技術文章：冰凍切片多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

　　冰凍切片多重免疫熒光試劑盒(三標四色)

　　原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色"步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合，使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用抗體洗脫液洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點)，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、組氨s酸和酪氨s殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯熒光素)，來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數大大增強。本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

　　試劑盒規格：100T

　　試劑盒組成：

　　名稱規格保存條件

　　TYR-520熒光染料(綠光)即用型，5mL-20℃

　　TYR-570熒光染料(紅光)即用型，5mL-20℃

　　TYR-690熒光染料(粉光)即用型，5mL-20℃

　　TSA+增強劑(可選)濃縮型，50μl-20℃

　　抗體洗脫液即用型，30mLRT

　　HRP-山羊抗兔二抗即用型，15mL4℃

　　備注：TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍。

　　TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

　　操作流程：

　　爬片準備：多聚甲醛固定15min，PBS洗滌三次，每次5min，Tritonx100 破膜15min，PBS洗滌三次，每次5min。

　　阻斷內源性過氧化物酶：滴加3%過氧化q溶液，室溫避光孵育15 min， PBS洗滌3次，每次5min。

　　BSA封閉:滴加用3% BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋細胞爬片，室溫封閉30min(如果爬片蓋玻片較大可用組化筆在蓋玻片四周畫圈)。

　　加一抗：輕輕吸掉封閉液，滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，避光4°C孵育過夜。

　　加hrp二抗： PBS洗滌3次，每次5min。滴加與一抗相應種屬的hrp二抗，避光室溫孵育50min,PBS洗滌3次，每次5min。

　　熒光染料反應：TYRXXX熒光染料反應 2-15min，PBS洗三次，每次5min。

　　上一輪抗體洗脫：滴加適量37度預熱至溶解的抗體洗脫液覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘。

　　重復2-6步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

　　DAPI復染細胞核： PBS洗滌3次，每次5min。棄PBS，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min，PBS洗三次，每次5分鐘。

　　封片：干凈的載玻片做好標記，用針輕輕挑出蓋玻片，用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　鏡檢拍照：樣本于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。

　　染料激發波長發射波長

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480450480

　　TYR-520綠色490520

　　TYR-570紅色550570

　　TYR-620590620

　　TYR-690630690

　　TYR-780750780

　　文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Four-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

　　冰凍切片多重免疫熒光試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。