摘要：RNA 干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA 所引起的序列特異性基因沉默。它是真核生物中基因轉錄后沉默作用的重要機制之一。RNAi 技術作為新興的基因阻抑方法，在功能基因組學、微生物學、基因表達調(diào)控機理研究等領域得到了廣泛應用。本文就其作用機制、基本實驗程序及注意事項作了較詳細的綜述，對其存在的相關問題和前景亦做了展望。
關鍵詞：RNAi；sirna；轉染
小RNA 作用與應用研究繼2001，2002 連續(xù)兩年被美國science 雜志評為年度10 大突破技術以來，近年來繼續(xù)熱度高漲，名列前矛。其核心技術RNA 干擾（RNAi），即用20 多個核苷酸組成的短的雙鏈RNA（siRNA）代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進行轉錄后基因沉默，已經(jīng)迅速而廣泛地應用到基因功能，基因表達調(diào)控機制研究等熱門領域，不僅如此，它還為基因治療開辟了新的途徑。此外，RNAi 沉默機制的探索也取得了相當?shù)倪M展。目前，在大致勾畫出生物體內(nèi)源性小RNA 的重要作用框架后，進一步闡述其作用細節(jié)、探索小RNA 對細胞行為的調(diào)控、如何利用RNAi 進行疾病防治等等都成為生物學家研究的一大熱點。

1、 RNAi 的作用機制

通過生化和遺傳學研究表明，RNA 干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA 被切割為21-23 核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs)。證據(jù)表明;一個稱為Dicer 的酶，是RNase III 家族中特異識別雙鏈RNA 的一員，它能以一種ATP 依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA 降解為19-21bp 的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2 個堿基突出。在RNAi 效應階段，siRNA 雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA 誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC 需要一個ATP 依賴的將小分子RNA 解雙鏈的過程。激活的RISC 通過堿基配對定位到同源mRNA 轉錄本上，并在距離siRNA3’端12 個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC 都包含一個siRNA 和一個不同于Dicer 的RNA 酶。另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA 在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt 長的片段，這種dsRNA 可使內(nèi)源相應的DNA 序列甲基化，從而使啟動子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理見（圖1）：
RNA 干擾(RNAi)實驗技術相關探討
圖1、RNAi 的作用機制

2、RNAi 基本試驗程序及注意事項
2.1、 siRNA 的設計
2.1.1、目標序列的篩選
在設計RNAi 實驗時，可以先在以下進行目標序列的篩選：
http://www.genesil。。ｃｏｍ/business/products/order2.htm
http://www.ambion。。ｃｏｍ/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.1.2、RNAi 目標序列的選取原則
RNAi 目標序列的選取原則應遵循以下幾個方面的原則：(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3"端的19 個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC 含量在45%—55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更為有效。Tuschl 等建議在設計siRNA 時不要針對5"和3"端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結合區(qū)域，而這些UTR 結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP 核酸內(nèi)切酶復合物結合mRNA 從而影響siRNA 的效果。(2)將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） (3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。
2.1.3、陰性對照
一個完整的siRNA 實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA 應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA 沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA 序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。