ELISA法檢測立克次體

    立克次體（Rickettsia）是一類專性活細胞內(nèi)寄生的原核細胞微生物，具有細胞壁，含有RNA和DNA，以二分裂繁殖。需在細胞內(nèi)繁殖，不能在無細胞的人工培養(yǎng)基中生長。它是屬于人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上常見的有普氏立克次體、莫氏立克次體、恙蟲病立克次體和Q熱立克次體等，它傳播的疾病主要是斑疹傷寒、恙蟲病和Q熱。檢測血清中立克次體的特異性方法包括：免疫熒光法、ELISA、間接血凝法、乳膠凝集法和微量凝集法等。ELISA法特異性強、敏感性高、可重復性好，現(xiàn)已廣泛應用于檢測各種立克次體感染，但其缺點是需要使用純化的抗原。

    [檢測方法]ELISA法

    方法學原理，  將可溶Q熱立克次體吸附于固相載體上，洗去未吸附的抗原，加入待檢血清使其與載體上吸附的抗體連接，洗滌后加入酶標記的抗人血清球蛋白，溫育后漂洗，加底物溶液，底物降解出現(xiàn)呈色反應，顏色改變的程度與待檢血清的含量成正比。

    [標本準備]

    取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進行試驗，分離血清后將其保存于-20℃環(huán)境中。檢測時，使樣本恢復至室溫。

    [試劑]

    1．0．05mol／LpH 7．4 PBS-Tween-20

    2．0．01mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液

    3．HRP標記抗人球蛋白血清

    4．鄰苯二胺底物溶液

    5．2mol／L H2S04

    6．純可溶性Ⅱ相Q熱立克次體抗原（制備方法見微量凝集試驗檢測Q熱立克次體抗體）

    [儀器）  酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

    （檢測步驟]

    1．用0．05mol／LpH 9．6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原使成每毫升含蛋白10／1g左右，包被酶標板，每孔0．2ml，于37℃環(huán)境中2h后，于4℃環(huán)境中過夜。

    2．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，用于。

    3．被檢血清經(jīng)含1g／L牛血清清蛋白的PBS-Tween-20作l：200稀釋，加人相應孔中，同時加2孔已知陽性對照和2孔陰性對照，放37℃環(huán)境中2h。

   4．用0．Olmol／L pH 7．4 PBS-Tween—20洗3次，甩干。

    5．加酶標記抗體，每孔0．2ml，37℃環(huán)境中2h。

    6．用0．01mol／L pH 7．4 PBS-Tween-20洗3次，甩干。

    7．加底物溶液，每孔0．2ml，室溫避光保存15—30min，各孔加入2mol／l H2S04 1滴終止反應，用酶標光度計490nm測每孔吸光度值（A值）。

      Q熱立克次體抗體陰性

    注意事項

    1．可溶性抗原必須純凈，否則影響結果。

    2．每次試驗應同時做2份陽性及2份陰性對照。

    3．其他注意事項同檢測HBsAg的ELISA。