ELISA的原理、類型及選擇

　　ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。該技術(shù)自70年代初問世后迅速應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

　　ELISA的原理，這一塊相信小伙伴們都是非常熟悉的了，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔(當(dāng)然就是我們熟知的96孔板啦)中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。

　　01 直接法原理

　　直接法是利用包被抗原，檢測抗體或者進行重組蛋白的活性驗證，利用蛋白與板材(即微孔板底)通過疏水鍵、流水/離子鍵的被動吸附,通過引入其它活性基團如氨基和碳基的共價結(jié)合，以及通過表面改性后的親水鍵結(jié)合等等，當(dāng)然也有利用親和素預(yù)包被的板材，通過親和素與生物s的共價結(jié)合及親和素有四個殘基理論可結(jié)合個生物s的特性，使結(jié)合的蛋白更多，靈敏度進一步提高，目前只是該方法的成本會升高。

　　直接法相對來說靈敏度和特異性較其他方法低，目前使用較少，通常用于重組蛋白或重組抗體的結(jié)合活性驗證。而使用親和素包被的板材主要原因在于大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，當(dāng)然好的板材也是成功的一半，聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能。各方面表現(xiàn)較為均衡，是ELISA 反應(yīng)中的固相載體。小分子蛋白由于吸附性較差，固使用這樣間接包被的形式才能起到理想的固定形式。

　　02間接法原理

　　間接法相對直接法，靈敏度進一步提升，利用一抗與抗原的特異結(jié)合，再加入通用二抗(即檢測抗體)，如一抗使用的抗某蛋白的鼠抗，二抗可使用鼠/兔等抗該類型抗體(IgG)的抗體，利用抗體的特異性識別，加之顯色用的二抗非直接與抗原結(jié)合，所以稱之為間接檢測，該方法一般用于抗體的檢測，如重組抗體，或疫苗效價的檢測，咱們打疫苗的目的就是產(chǎn)生中和抗體嘛，該方法在IVD企業(yè)使用較多。

　　03夾心法原理

　　夾心法使用的是兩個抗體夾抗原或者兩個抗原夾抗體的方法，這種復(fù)合物被稱之為三明治夾心結(jié)構(gòu)，利用一對配對的抗體，可以特異性檢測抗原，當(dāng)然主要針對的是具有至少2個以上抗原表位的抗原，畢竟有兩個抗體來結(jié)合嘛，抗體的配對可是門技術(shù)活，很多公司可以生產(chǎn)抗體，但是配對卻很少做，主要原因在于篩選的難度，可能開發(fā)的幾十株針對同一抗原的抗體，都很難有一對合適的可以配對，原因是多方面的，有抗原的表位、構(gòu)象等原因，也有抗體效價的原因，當(dāng)然還有篩選成本的原因，所以每一個ELISA試劑盒都是經(jīng)過多次和長期的驗證得來的哦!且用且珍惜!

　　那么雙抗原夾抗體也就好理解了，是兩個抗原共同結(jié)合一個抗體，也是用于抗體的檢測!

　　04競爭法原理

　　競爭法的使用相對來說就窄一點了，其原理是利用抗原抗體結(jié)合的可逆性(晶格學(xué)說)，但在合適濃度時又可達到結(jié)合和解離的穩(wěn)定期，那么親和力更強的抗體自然就能更有效的結(jié)合抗原了。一般結(jié)合的解離使用最多的就是SPR和BLI技術(shù)了，可以高精度或高通量的測抗原/抗體、受體/配體的親和力。

　　利用已知的抗原進行標(biāo)記(抗原A)，作為對照，實驗組加入樣本(抗原B)及標(biāo)記抗原，與對照組相比，顯色低，則該抗原A與抗原B競爭結(jié)合抗體，這種方法一般用于抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原。

　　包被抗體進行競爭法呢，一般用于ADA，競爭、非競爭抗抗體鑒定/篩選，抗抗體的競爭篩選是的免疫原性檢測手段之一。

　　操作步驟

　　說了這么多，原理小伙伴們應(yīng)該都非常清楚了，那么如何去做呢?Absin為大家整理了詳細的清單!強烈建議收藏!

　　樣本問題

　　細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除;立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋(因為細胞培養(yǎng)用的BSA會影響實驗結(jié)果，稀釋后影響減少)。

　　血清：使用血清分離管收集樣本，樣品室溫放置 30分鐘。離心 15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000 g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋(因為血清會影響實驗結(jié)果，稀釋后影響減少)。

　　血漿：使用 EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)速為1000 g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20°C冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑稀釋(因為血清會影響實驗結(jié)果，稀釋后影響減少)。

　　01檢測前準(zhǔn)備工作

　　使用前所有試劑和樣本需放置于室溫，靜置 15分鐘。建議所有的實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測。

　　洗滌液：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象;放置室溫，輕搖混勻，待結(jié)晶溶解后再配制洗滌液。依據(jù)所需用量計算濃縮洗滌液使用量，可將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的洗滌液。未用完的放4°C。

　　顯色劑：按當(dāng)次試驗所需要用量將顯色劑A 和顯色劑B 等體積混合，避光;在使用前15 分鐘準(zhǔn)備，現(xiàn)配現(xiàn)用;每孔需100 μL。

　　稀釋用緩沖液：依據(jù)所需用量計算濃縮稀釋劑使用量，可將濃縮稀釋劑用蒸餾水或去離子水稀釋配置成工作濃度的稀釋劑。

　　SA-HRP：如提供的為濃縮 SA-HRP ，則需使用稀釋用緩沖液(1×)稀釋配置成工作濃度的1×SA-HRP,每孔需100 μL。檢測抗體：將干粉離心至管底，檢測抗體的重溶體積請參考瓶身標(biāo)簽，用稀釋用緩沖液重懸至相應(yīng)體積。(未用完的檢測抗體溶液可保存于4°C冰箱。)

　　標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液重溶，重溶體積請參考瓶身標(biāo)簽，按說明書制備標(biāo)曲所用的稀釋方式配置。

　　02實驗操作步驟

　　加樣：加一定稀釋的待檢樣品100 μL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

　　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(按照說明書進行稀釋)100 μL。37℃孵育0.5～1小時，洗滌3次。

　　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μL，37℃10～30分鐘。

　　※ 加入終止液后30 分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm 的吸光度值，設(shè)定540nm 或 570nm 作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響;

　　※ 計算結(jié)果：將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD 值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD 值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。

　　注意事項

　　1)正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　2)實驗材料的保存比較重要，一般需要注意的點如下：

　　※ ELISA試劑盒一般是4℃保存，如果有溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品次日需要使用，則需要-20℃，防止降解導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn);

　　※ 未使用的標(biāo)準(zhǔn)品與未用完的試劑盒一起保存，一般試劑盒拆分后建議一周內(nèi)使用，由于濕度等影響，長期放置易引起產(chǎn)品的不穩(wěn)定;

　　※ 對于洗滌，常規(guī)建議機洗，有些較為老款的洗板機由于時間較久，可能加液沖力較大或有固定的洗滌液，可能會導(dǎo)致結(jié)果異常，需慎重選擇;

　　※ ELISA試劑盒正式實驗前，建議先進行預(yù)實驗，避免出現(xiàn)濃度超出檢測限導(dǎo)致的結(jié)果無法使用的情況;

　　※ 各家試劑盒可能略有差異，使用前建議詳細閱讀說明書。

　　ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。