六色多重熒光免疫組化染色試劑盒（鼠兔通用二抗）

　　原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶( HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法， 類似常規免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗， 同樣有對應的 “顯色"步驟 (HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物， 產生 活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合， 使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光 素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物， 重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復就可實現多重標記。

　　TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結合位點)， 產生大量的酶促產物， 該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、 組氨s和酪氨s殘基)結 合， 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積， 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。 簡單 來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯熒光素) ， 來催化后續 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨s殘基 共價偶聯， 使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理， 前一輪非共價 結合的抗體被洗掉， 共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。 再換個一抗來第二輪孵育 ， 周而復始。 等到所有抗體孵育結束， 熒光素都結合好后， 最后去檢測結果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔心抗體交叉反應， 以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說， 如果用 TSA 技術， 同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗， 而且信號放大的倍數大大增強。 本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中以下一種或者多種： TYR-480， TYR-520， TYR- 570， TYR-620， TYR-690， TYR-780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。 可以實現單標、 雙 標、 三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內涵。

　　試劑盒組成： TYR-520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃; TYR-570 熒光染料 (紅光) (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-620 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-690 熒光染料 (即用型， 5mL)， - 20℃; TYR-780 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增強劑， 100ul， -20℃ (可選) ;

　　高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (15mL) 4℃ (可選) 。

　　備注： TYR-520 熒光染料 、TYR-570 熒光染料、 TYR-620 熒光染料、 TYR-690 熒 光染料、 TYR-780 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

　　TSA+增強劑使用方法： TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強劑： TYR 熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強劑不是必須的選項， 可以根據具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

　　操作流程：

　　1、 石蠟切片脫蠟至水： 依次將切片放入二甲b Ⅰ 15min-二甲bⅡ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內， 酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。

　　2、 抗原修復： 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內進行抗原修復 (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法) 。 中火 8min， ?；?8min， 轉中低火 7min， 此過程中應防止緩沖液過度蒸發， 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定) 。

　　3 、 阻斷內源性過氧化物酶： 切片放入 3%過氧化氫r液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。

　　4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) ， 在圈內滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。

　　5、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X， 切片平放于避光濕盒 內 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內加少量水防止抗體蒸發)

　　6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。

　　7、 熒光染料反應： TYRXXX 熒光染料反應 10-15min， PBS 洗三次。

　　8、 重復 2-7 步驟 (換用另外一種 TYRXXX 熒光染料)

　　9、 DAPI 復染細胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。

　　10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。

　　11、 鏡檢拍照： 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖 像。

　　染料 激發波長 發射波長

　　DAPI 藍色 350 420

　　TYR-480 450 480

　　TYR-520 綠色 490 520

　　TYR-570 紅色 550 570

　　TYR-620 590 620

　　TYR-690 630 690

　　TYR-780 750 780

　　TSA+增強劑的用法： TSA+增強劑在 4 度或者-20 度是固體狀態， 使用之前需要解凍; 將增強劑按 比例加入到熒光反應工作液中， 反應信號提高 5-10 倍， 適用于信號比較弱的情況， TSA+增強劑不 是一定要加入到熒光反應液中， 是可選擇的， 根據具體情況而定， 具體使用方法： TSA+增強劑： TYR 熒光反應液=1:500

　　文獻引用格式： Co-staining of A, B， C， D and E was performed using a Six-color multiple immunofluorescence Kit ( GuduoBio Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

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