ELISA試劑盒科研實驗中的操作技巧與注意事項

　　在Elisa試劑盒檢測實驗中，包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保留抗原很重要，做重組蛋白時，要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑，從而排斥Elisa后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。但有時因為試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。

　　試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。該法適于測定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細(xì)胞因子(或受體)的水平。

　　操作技巧：

　　1.加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。

　　2.合理安排檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。

　　3.吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

　　4.要盡量做雙孔實驗，這樣才既能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，又能反映出試劑盒的精密度。

　　5.樣品稀釋液應(yīng)用加液器加注，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性。

　　6.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

　　7.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG工作液。

　　8.ELISA試劑盒實驗中，加樣后及時放人孵箱，標(biāo)本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗。

　　9.剩余樣品及廢棄物應(yīng)經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，或用5.0g/L次氯酸鈉等消毒劑處理30分鐘后廢棄。

　　10.人ELISA試劑盒洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

　　11.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

　　12.手工洗板時每次加入洗滌液后。應(yīng)靜置15～30s，不要將一個酶標(biāo)孑L中的洗滌液濺入另一酶標(biāo)孔中，防止交叉污染。甩去洗滌液后將酶標(biāo)板放在毛巾或吸水紙上拍干。

　　13.對樣本的結(jié)果有疑問時需要使用其他檢測方法進(jìn)行驗證。

　　14.沒有去離子水或雙蒸水時，可以使用娃哈哈純凈水配制溶液，切勿使用自來水。

　　15.在使用微量加樣器時，吸取不同瓶子中液體后要更換槍頭，即使吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　16.吸取液體時速度不易太快，以免產(chǎn)生氣泡，人ELISA試劑盒吸取的量不夠準(zhǔn)確。

　　17.吸取液體時要選用量程和需要量接近的微量加樣器吸，減少誤差。

　　注意事項：

　　1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。

　　2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

　　3.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

　　4.所有液體組分使用前充分搖勻。

　　按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。

　　試劑盒的配制：對于每種細(xì)胞因子應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，注意每批的細(xì)節(jié)。在使用細(xì)胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細(xì)胞因子。根據(jù)每批說明書中的細(xì)節(jié)，將凍干的細(xì)胞因子復(fù)溶。一般待測抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍的可通過將標(biāo)準(zhǔn)品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml到15pg/ml。可利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。為了優(yōu)化靈敏度，建議孵育標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本。若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物ELISA試劑盒酶的活性。

　　試劑盒的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點。

　　洗板方法：

　　手工洗板，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板，如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

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