實驗原理：免疫熒光細胞化學染色方法

　　一、標本制作

　　可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。

　　二、熒光抗體染色方法

　　(一)直接法

　　1.染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等)，在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。

　　2.洗片 　傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。

　　3.用50%緩沖(0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5)甘油封固、鏡檢

　　4.對照染色

　　①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。②染色抑制試驗(一步法)：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清(相同)等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩定。③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。

　　直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。

　　(二)間接法

　　(1)切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

　　(2)再滴加間接熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

　　對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。③陽性對照。

　　間接法中上述方法稱雙層法(Double Layer Method)。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：

　　①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內。

　　②滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

　　③緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。

　　④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

　　⑤如③水洗。

　　⑥緩沖甘油封固，鏡檢。

　　間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體(如麻疹)等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。

　　(三)補體法

　　1.材料

　　(1)免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價，如為1：32則免疫血清應作1：8稀釋。

　　(2)補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

　　(3)抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

　　2.方法步驟

　　(1)涂片或切片固定。

　　(2)吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液(此時免疫血清及補體又都稀釋一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內。

　　(3)用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周圍水液。

　　(4)滴加經過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同(3)。

　　(5)蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

　　3.對照染色

　　(1)抗原對照。

　　(2)抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。

　　(3)滅活補體對照：將補體經56℃30min處理后，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進行補體法染色。

　　本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用，敏感性亦較間接法高，效價低的免疫血清亦可應用，節　省免疫血清，尤其是對檢查形態小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。

　　(四)膜抗原熒光抗體染色法

　　本法應用直接法或間接法的原理和步驟，可對活細胞在試管內進行染色，常用于T和B細胞、細胞培養物、瘤細胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細胞膜上。FACS即采用此法原理。

　　(五)雙重染色法

　　在同一標本上有兩個抗原需要同時顯示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用羅達明標記，可采用以下染色方法：

　　1.一步法雙染色　 先將兩種標記抗體按適當比例混合(A+B)，按直接法進行染色。

　　2.二步法雙染色 先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標記的A抗體染色，按間接法進行。

　　結果：A抗原陽性熒光呈現綠色，B抗原陽性呈現桔紅色熒光。

　　(六)熒光抗體再染色法

　　若切片或其他標本經某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結果，而又疑有另外的病原體存在時，可用相應的熒光抗體再染色。

　　有時存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細胞化學的染色。

　　三、熒光抗原染色法

　　某些抗原可以用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細胞或組織內的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。

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