細胞增殖檢測試劑盒說明書

　　細胞增殖檢測試劑盒

　　原理：EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團在天然化合物中很少見，在細胞增殖時能夠替代胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine) 插入正在復制的DNA分子中， EdU上的乙炔基能與熒光標記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488等)通過一價銅離子催化發生共價反應，形成穩定的三唑環，該反應非常迅速，被稱作點擊反應(Click reaction)，從而可以進行高效快速的檢測細胞增殖，特別是可以有效地檢測處于S期的細胞百分數。

　　與傳統的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比， EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細胞內更容易擴散，不需要嚴格的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細胞增殖的真實情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。

　　規格：200T

　　有效期：12個月

　　試劑盒組成

　　貨號Code品名Product name儲存條件Storage condition

　　10mL-20℃

　　1mL*2-20℃

　　400μL-20℃

　　色原50μL-20℃

　　EdU母液 100μL-20℃

　　備注：AC為粉劑，使用之前需要加入1mL純水，充分溶解之后再使用，AC容易氧化失效，不使用時放入冰箱-20度保存，如發現變色，需更換新鮮試劑。

　　實驗流程

　　1.樣本處理

　　1.1動物實驗

　　1.1.1動物EdU注射

　　對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。

　　注射方式:依據客戶實驗而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔注射為多。

　　6小時后或根據特定實驗確定適當的時間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照常規步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時候也可參考相關文獻自行調整。

　　建議任何實驗均可取小腸組織檢測細胞增殖情況，小腸上皮組織細胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小時后即可檢測到陽性信息，可用作陽性對照進行預實驗。

　　1.1.2切片處理

　　切片前處理：組織器官最好進行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

　　切片厚度：3-10μm為宜，切片過厚可能會影響切片背景及染色效率。

　　切片后處理：

　　石蠟切片脫蠟：二甲苯脫蠟2次，15分鐘/次，梯度乙醇(100%，95%，85%，75%)各一次，5分鐘/次，去離子水洗脫1次。

　　冰凍切片處理：室溫放置30分鐘后，固定10分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

　　1.2細胞實驗

　　1.2.1細胞EdU標記

　　用細胞培養基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養基;

　　每孔加入適量50μM的EdU培養基孵育2小時，棄培養基(最佳孵育時間一般為細胞周期的1/10),EdU培養基和EdU反應液孵育體積可參考下表;

　　3)PBS清洗細胞3次，每次5分鐘

　　96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板5.5cm小皿

　　EdU培養基100μL200μL300μL500μL1mL2mL

　　EdU反應液100μL200μL300μL500μL1mL2mL

　　1.2.2細胞固定通透

　　1)每孔加入細胞固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室溫孵育15分鐘，棄固定液，PBS 清洗3次，每次5 分鐘。;

　　2)每孔加入滲透劑(0.5% TritonX-100 的 PBS)脫色搖床孵育 15 分鐘;PBS 清洗3次，每次5 分鐘。

　　2.EdU反應

　　按照PB：CU：AC：647色原=860：40：100：5的比列配制EdU反應液(反應液現配現用)。

　　每個樣本滴加50-100μL的EdU染色反應液(反應液均勻覆蓋樣本)，室溫避光孵育15-60分鐘，棄染色反應液，PBS沖洗3次，每次5分鐘。

　　3.DAPI染色

　　每個樣本加入50-100μL DAPI染色液，染色15分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

　　4.圖像拍照

　　染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者全片掃描儀進行采集圖像，染色完玻片避光4℃保存。

　　以上是50mg/kg標記小鼠6小時的染色圖像

　　實驗前須知

　　EdU 的分子量為 252.23，易溶于水，PBS，生理鹽水。

　　對于動物實驗，建議將EdU粉末溶解于DMSO配制成100mg/ml的母液。

　　EdU 建議初始給藥量為 50mg/kg(50μg/g)，稀釋濃度為 0.5~1mg/mL。小鼠體重20g，需要注射1mg，以1mg/mL計算，需要注射1mL。

　　Edu0.1mg1mg2mg10mg

　　PBS100μL1mL2mL10mL

　　對于細胞實驗， EdU母液質量濃度為100mg/mL，轉化為物質的量濃度為400mM，建議將EdU母液稀釋成50mM儲存液，推薦的EdU工作濃度為10μM。

　　文章引用試劑盒/方法：Staining of EdU was performed using a EdU cell proliferation Assay kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the click chemistry technology according to the manufacture’s instruction.

　　試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。