間接免疫熒光法檢測自身抗體

　　自身抗體診斷的標準技術是間接免疫熒光法，其特點是特異性強，陽性與陰性樣品的信號強度對比明顯，通過顯微鏡觀測能夠精確地判斷組織或細胞內熒光的分布。自身抗原的位置決定了其相應抗體的典型的熒光模式，所有與此典型模式不相關區域的染色被認為是非特異性染色。即使偶爾伴有強的非特異性染色，但弱的特異性信號也能夠被識別。間接免疫熒光法不需要復雜、費時的化學制備程序，而酶聯免疫吸附測定等實驗，要取得高特異性則必須提取和純化抗原，并將其吸附于固相載體上，如果抗原不純，則相關抗體會出現假陽性結果。 間接免疫熒光法保留了原基質的完整抗原譜，因而可同時檢測大量抗體.獲得較高的檢測效率。當抗幾種不同抗原的抗體需要在一種生物基質上同時檢測時(如抗細胞核抗原抗體)，或為每一種實驗逐一準備抗原很困難或相當復雜時，就應該選擇免疫熒光法。另外，應用免疫熒光法還可檢測到一些至今未知的抗體。

　　在沒有熒光顯微鏡時，可嘗試用酶標記的第二抗體代替熒光標記的抗體，但是檢測的質量會明顯下降。因為在免疫熒光法中，指示劑染色是通過抗體直接結合在細胞抗原上產生的，而免疫酶法，染色則是彌散地圍繞在抗原周圍的區域。因此免疫酶法并不總是像免疫熒光法那樣能區分抗原分布的細小差別。而且應用酶染色時，會導致許多自身抗體不能被區分或根本測不到。僅應用細胞核制備物免疫酶染色的純光度法評價也是不可取的，因為這不可避免地導致一些自身抗體被漏檢。

　　實驗室工作者需要經過一定的專業訓練并不斷實踐，方可勝任熒光顯微鏡下的讀片工作。顯微鏡下的結果判斷，為綜合知識的體現，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。

　　(一)實驗基質的選擇和血清的稀釋度

　　1.實驗基質的選擇用間接免疫熒光法對自身抗體進行測定的效果，在很大程度上取決于基質的質量(包括基質本身的質量及制備的質量)。這些實驗基質，通常是用動物或人類的細胞或組織，經一系列方法進行處理，如Hep-2細胞的培養、吸附和固定，玲凍組織切片的制備、貼片等。國內不少實驗室仍在自制實驗基質，這已越來越不適應實驗標準化、規范化、現代化的需要，建議應盡可能選擇生產工藝先進、質控措施嚴格的商品化試劑盒，以保證實驗結果準確可靠。檢測不同的自身抗體應選擇不同來源的實驗基質(不同動物的不同組織)。

　　2.血清的稀釋度　一般來講，一個待測標本，要測定某種或多種自身抗體，通常需要先測定一個起始稀釋度。如該稀釋度的檢測結果為陰性，則認為該抗體或多種抗體不顯著存在(無臨床價值)，通常無需稀釋標本做進一步檢測。如果該稀釋度的檢測結果為陽性，則認為該抗體明顯存在(可能有臨床意義)，可將標本做進一步稀釋，以獲得該抗體的滴度。因此確定待測標本合適的起始稀釋度，顯得十分重要。由于待測血清的起始稀釋度是結合臨床統計所得，而不同的實驗室采用的方法學有差異，故不同實驗室的血清起始稀釋度可能不同。另外，為了避免前帶現象的發生，有時對可疑的陰性標本，尚需進一步的稀釋后進行測定。

　　(二)實驗操作的標準化滴定平板技術

　　實驗標準化流程為滴加樣品、標記抗體至加樣板，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應同時開始。因為液體被局限在一封閉的空間，不再需要傳統“濕盒"，可同時在一致的反應條件孵育大量的標本。下面以間接免疫熒光法為例，介紹滴定平板技術的操作過程：

　　1.準備　檢查加樣板：觀察是否反應區親水而周邊疏水，如果不是，用濕紙巾擦干凈，隨后從試劑盒中取出載片，等平衡至室溫時方可打開包裝。注意不要觸摸生物薄片，用筆編號、標記。

　　2.稀釋血清　根據使用者實驗設計，用PBS-Tween緩沖液稀釋血清，每次實驗均需陽性、陰性對照，使用前要混勻。

　　3.加樣　按順序分別滴加25ul稀釋后血清至加樣板每一反應區，避免產生氣泡。滴加完所有待測標本后再開始溫育。

　　4.第一步溫育　將載片貼有基質的一面朝下蓋在加樣板的凹糟里，反應即開始。室溫下溫育30分鐘。

　　5.沖洗　用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗載片1秒鐘(注意水流不要太急，不要直接對著基質)，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯，浸洗至少1分鐘。

　　6.加樣滴加20ul異硫氰酸熒光素標記的抗人球蛋白至一潔凈加樣板的反應區，加完方可繼續溫育。異硫氰酸熒光素標記抗人球蛋白使用前需混勻，用PBS-Tween緩沖液稀釋。

　　7.第二步溫育從PBSTween緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內用吸水紙擦干背面和邊緣后，立即蓋在加樣板上，注意不要擦拭反應區。注意避免陽光直接照射載片，室溫溫育30分鐘。

　　8.沖洗用燒杯盛PBS—Tween緩沖液流水沖載片1秒鐘(水流不要太急，不要直接對著基質)，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少1分鐘。

　　9.封片加甘油/PBS至蓋玻片，每一反應區約10ul。從pBS-Tween緩沖液取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區間鯨。將蓋玻片輕輕蓋在載片上。

　　10.結果判斷　熒光顯微鏡下觀察熒光。

　　(三)抗體檢測的質量控制及注意事項

　　l.質量控制　自身抗體檢測的質量控制是用多種手段對自身抗體存在與否、濃度的多少進行控制和評價，有利于實驗室內部、實驗室之間對同一標本獲取相同具有可比性的結果，是衡量實驗室檢測水平的一個重要指標。然而.自身抗體檢測的質量控制，并不是一件容易的工作。因為不同實驗室所用的抗原基質存在差異、抗原的固定方法有差異或不同，血清的稀釋方法不同以及操作者對不同熒光模式的識別能力不同等，均可影響到自身抗體的檢酒質量。實驗室在進行臨床檢測時，應同時檢測陽性對照、陰性對照，以監測結果的準確性。國內急需成立專門的學術機構，參照國際標準，與國際接軌，建立自己當地的標準，開展自身抗體檢測的質量控制。

　　2.實驗結果的進一步確認(兩級測定)　間接免疫熒光法，提供了對自身抗體進行篩選的理想途徑。許多情況下，僅使用該方法就可為臨床提供足夠的診斷信息，不需要做進一步的實驗。在自身抗體的檢測中，稱間接免疫熒光法為“水平1測定"。如果有必要對自身抗體進行進一步的單特異性區分，則可應用其他方法，如酶免疫測定法、對流免疫電泳及免疫雙擴散法等，稱這些實驗為“水平2測定。酶免疫測定法所用的抗原必須為純化的。許多抗原不易被純化，且很多自身抗體的確切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2細胞柱測到的抗體及小部分組織抗體，進行進一步單特異性檢測。然而抗體的最終區分，需要使用純化的抗原作為實驗基質。單獨的“水平2"測定，不能適應自身抗體檢測的需要。特別是對抗核抗體的測定，單做“水平2"測定將會漏掉某些自身抗體，故必須同時用免疫熒光法進行檢測。

　　3.實驗報告及解釋

　　(1)陰性：在整個檢測系統(包括各種質控)正常的情況下，當待檢標本在合適的起始稀釋度下，實驗基質沒有明顯的熒光染色，或沒有可辨認的熒光模型時，稱此待檢的血清樣本的某種自身抗體陰性。

　　(2)陽性：整個檢測系統(包括各種質控)正常的情況下，當血清待檢標本在合適的起始稀釋度下，產生明顯高于陰性對照的特異熒光，且有明鮮可以辨認的熒光模式，稱此待檢血清標本的某待檢抗體陽性。

　　注意，有時申請報告中，申請檢測的自身抗體結果為陰性，而發現其他自身抗體為陽性。在這種情況下，如果該檢測到的自身抗體有明顯的臨床意義，則要報告此結果。如該自身抗體無明確臨床意義，則可不報告，以避免造成混亂。但如果臨床醫生與實驗室工作者進行研究合作，則可報告或另外進行交流。

　　(3)免疫熒光模式;對陽性結果應報告其熒光模式，以初步提供自身抗體針對的靶抗原特異性，為進一步進行“水平2"檢測提供信息。

　　(4)滴度：滴度的定義為：與相同稀釋倍數的陰性血清比較，能觀測到的特異性的熒光反應的最高稀釋度。檢測結果應該報告滴度，為臨床提供動態的信息，因為自身抗體陽性患者，在診斷和治療過程中，要做多次檢測，且有些自身抗體的滴度與病情密切相關。

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