古朵課堂——免疫組化抗原修復方法
 

　　大多數甲醛固定的組織在開始染色之前都需要先修復抗原，這是由于在固定過程中產生了亞甲基橋使蛋白之間交聯屏蔽了抗原位點。兩種抗原修復方法為熱修復法(稱之為熱誘導抗原表位修復或HIER)和酶解法。

　　一、熱修復法

　　1. 熱修復緩沖溶液

　　下面是三種HIER較為常用的緩沖溶液，對于一個特定的抗體，在沒有其他研究者建議的情況下，要通過實驗確定選用哪種修復緩沖液。

　　1) g櫞酸鈉緩沖液(10 mM Sodium Citrate，0.05% 吐溫- 20, pH 6.0)

　　2) 1 mM EDTA, 調至pH 8.0

　　3) Tris/EDTA 緩沖液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液， 0.05% 吐溫-20, pH 9.0)

　　2. 熱修復方法

　　a) 高壓蒸汽法

　　玻片要置于金屬架上

　　1)材料及試劑

　　• 家用不銹鋼高壓鍋

　　• 加熱板

　　• 玻片架放置容器(容量大約400-500ml)

　　• 抗原修復緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉pH 6.0)

　　2)方法

　　1. 將合適的抗原修復緩沖液加入高壓鍋內，然后將鍋置于加熱板并開至最大功率，此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中，進行脫蠟至水。

　　2.煮沸后，將玻片從自來水中取出放入高壓鍋內。小心熱溶液- 使用鑷子。依照說明書加上加壓閥。

　　3.高壓鍋達到最大壓力后，維持3分鐘。

　　4.3分鐘過后，關掉加熱板，將高壓鍋取下放置。

　　5.打開高壓鍋閥門，冷水冷卻鍋身。壓力降下后，打開鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。

　　6.繼續染色。

　　b) 微波法

　　1)材料和試劑

　　• 家用(850W)或科研專用微波爐

　　• 微波爐專用玻片放置架及容器(容量大約400-500ml)或染色缸

　　• 抗原修復緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等)

　　2)方法

　　1.將切片脫蠟至水。

　　2.向微波爐專用容器中加入合適的修復緩沖液。

　　3.從自來水中取出切片并放入容器中，置于微波爐內。如果用家用微波爐，就將之開到最大功率至開始沸騰并煮沸20分鐘。如果采用科研專用微波爐，就將溫度設置在98°C維持20分鐘以修復抗原。

　　4.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。小心熱溶液。

　　5.繼續染色。

　　c) 蒸煮鍋法

　　1)材料和試劑

　　• 蒸煮鍋

　　• 玻片放置架及容器(容量大約400-500ml，如果采用Tissue–Tek容器大約250ml)

　　• 抗原修復緩沖液(如Tris/EDTA pH 9.0，g櫞酸鈉溶液pH 6.0，等等)

　　2)方法

　　1.將切片脫蠟至水。

　　2.依據用戶手冊設置蒸煮鍋并預熱。

　　3.在燒瓶中加熱適量修復緩沖液并煮沸。

　　4.將盛放玻片架的容器放置蒸煮鍋中。

　　5.將熱修復緩沖液小心加到容器中，然后放入玻片架。也可以采用更簡捷的操作，先向容器中加熱修復緩沖液再放入蒸煮鍋中。

　　6.加蓋。盛放緩沖液的容器也須配備蓋子。剛開始時玻片架可能會使修復溶液溫度降低，但幾分鐘內會回升到95-100°C之間。

　　7.達到溫度后維持20分鐘。

　　8.20分鐘后，取出容器放置水中冷卻10分鐘。

　　9.組織染色。

　　二.酶解抗原修復法

　　a)滴管法

　　1)材料和試劑

　　• 37°C孵育箱

　　• 加濕器(恒溫箱自帶或在容器內放入濕紙巾)

　　• 兩個盛TBS的玻片架容器

　　• 酶解抗原修復溶液(如y蛋白酶、w蛋白酶、蛋白酶K，等等)

　　2)方法

　　1.將y蛋白酶預熱至37°C。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般50-100µl即可)。用吸管將酶溶液鋪蓋住整個切片，注意不要弄壞組織。

　　2.將玻片置于加濕器內，然后37°C孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會因溫度不均影響染色質量。盛放玻片的容器最好先預熱再放入恒溫箱內。

　　3.10-20分鐘(需要優化)后，取出玻片，流水沖洗3分鐘。

　　4.繼續染色。

　　b) 侵泡法

　　1)材料和試劑

　　• 37°C 水浴

　　• 玻片架及玻片架容器

　　• 酶解抗原修復溶液

　　2)方法

　　1.將水浴溫度設置為酶最適宜的溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水。容器放入水浴中加熱。

　　2.按上述方法將切片脫蠟至水后放入水浴箱其中一個容器中加熱。

　　3.用水浴箱中另一個容器中的熱水制備酶解抗原修復緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。

　　4.將加熱過的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。

　　5.繼續染色。

　　熱修復法/酶解抗原修復法上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。