基于分子生物學(xué)和重組技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)和多肽已經(jīng)成為一類重要的藥物，但是其穩(wěn)定性差，生物利用率低，半衰期短等問題也日益受到關(guān)注。本文重點(diǎn)介紹了一些新的給藥途徑和給藥系統(tǒng)，例如鼻腔、頰等給藥途徑以及黏膜給藥系統(tǒng)、透皮給藥系統(tǒng)、緩控釋技術(shù)等給藥系統(tǒng)的進(jìn)展。綜述了對于蛋白質(zhì)和多肽藥物進(jìn)行定點(diǎn)突變和化學(xué)修飾，以達(dá)到增加其*性的一些新方法。
關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)；多肽藥物；*性；給藥系統(tǒng)；定點(diǎn)突變；化學(xué)修飾elisa試劑盒
由于20 世紀(jì)60
年代初固相多肽的合成以及70年代初期重組脫氧核糖核酸技術(shù)的產(chǎn)生，以及近年來分子生物學(xué)和基因重組技術(shù)的提高，蛋白質(zhì)和多肽越來越廣泛的被應(yīng)用于臨床，以攻克難以*的疾病。在zui近的一份調(diào)查報(bào)告中，324
種生物技術(shù)藥物(包括臨床試驗(yàn)或者正在接受管理部門審查的藥物)幾乎覆蓋了150
種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病以及艾滋病等傳染病。這些物質(zhì)中相當(dāng)數(shù)量都是蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)作為藥物的研究雖然取得了快速發(fā)展，存在的問題也日益突出，如給藥系統(tǒng)的不完善，穩(wěn)定性差，在體內(nèi)半衰期短，生物利用率低等。針對這些問題，科學(xué)家基本遵循兩種解決途徑，*是尋找一條蛋白質(zhì)藥物高生物利用率的給藥途徑；第二是通過化學(xué)修飾來優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝動力學(xué)特性，以延長其半衰期，達(dá)到*穩(wěn)定的目的。
1 影響蛋白質(zhì)和多肽藥物*性的因素影響蛋白質(zhì)和多肽藥物*性的主要因素[2]
：(1)當(dāng)藥物進(jìn)入系統(tǒng)時，由各種酶引起的代謝，尤其是多種形式的蛋白水解酶的作用，可導(dǎo)致藥物降解為小分子肽或者氨基酸。這類酶廣泛存在于胃、腸道、肝臟和腎臟等器官中[3]，其分布具有細(xì)胞組織的特異性。
(2)非蛋白酶因素的影響來源于蛋白質(zhì)物理或化學(xué)上的變化。物理變化包括聚合、沉淀；化學(xué)變化包括氨基酸殘基的修飾，主要有氧化作用、還原作用、脫酰胺反應(yīng)、水解反應(yīng)、β
消除、二硫化物交換等幾種反應(yīng)，并且蛋白質(zhì)在構(gòu)建中的穩(wěn)定性和免疫原性以及導(dǎo)致蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)錯誤變化的環(huán)境條件也被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)代謝穩(wěn)定性的主要因素。 (3)
較大的多肽常通過受體介導(dǎo)的方式來清除，有不少例子顯示，受體介導(dǎo)的清除可能是一種主要的清除機(jī)制。例如胰島素，若減少與受體的親和力就會顯著提高其血漿半衰期。受體介導(dǎo)清除的限速步驟是藥物與細(xì)胞表面受體形成非共價物的過程。受體清除具有細(xì)胞特異性。
(4)不同的給藥途徑對于藥物的體內(nèi)分布、代謝過程、生物利用度和藥理作用也具有顯著的影響。成功改造的蛋白質(zhì)依賴于對其理化和生物學(xué)特性的充分了解，包括化學(xué)和物理穩(wěn)定性、免疫原性和代謝動力學(xué)特性。蛋白質(zhì)的治療活性高度依賴于它的構(gòu)象結(jié)構(gòu)?？墒?，蛋白質(zhì)的構(gòu)象是可變的并且對外在環(huán)境十分敏感，這就是說，、設(shè)計(jì)和處理蛋白質(zhì)需要特別注重療效和安全性的*化，包括盡可能減少免疫反應(yīng)[4]。elisa試劑盒
2 給藥系統(tǒng)(drug-delivery
system，DDS)研究進(jìn)展口服是和zui廣泛適用的給藥途徑，但是這種途徑一般不適用于蛋白質(zhì)這樣的生物大分子的給藥。蛋白質(zhì)在胃腸道的內(nèi)在不穩(wěn)定性，以及由于較高的相對分子質(zhì)量和極性表面特性而對生物膜的低滲透性，表明蛋白質(zhì)在用于全身治療時只能避開胃腸道給藥。科學(xué)家還在進(jìn)行不斷的嘗試，通過選擇不同的給藥途徑達(dá)到較高的生物藥效率，如鼻腔或肺部途徑。盡管如此，非胃腸道給藥的生物藥效率很低并且通常不足以達(dá)到有效的全身效應(yīng)。近年來，給藥系統(tǒng)的研究有了十分樂觀的進(jìn)展，下面介紹幾條目前蛋白質(zhì)給藥的熱點(diǎn)途徑。
2.1 黏膜給藥系統(tǒng)(mucosal
drug delivery
system)
黏膜給藥系統(tǒng)是使用合適的載體在人體黏膜部位給藥，如鼻黏膜、口腔黏膜、眼黏膜、直腸黏膜、子宮及陰道黏膜，藥物透過黏膜進(jìn)入體循環(huán)產(chǎn)生全身或者局部治療作用的治療方式。黏膜給藥劑型需要具有生物黏附性的輔料，可用作釋藥系統(tǒng)的黏附材料包括天然聚合物，有明膠、脫乙酰殼多糖、凝集素、海藻酸鈉等，還有合成聚合物卡波姆(CP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)和聚乙二醇(PEG)等。這些聚合物能很好地黏附于水性生物膜上，從而使藥物在病灶部位既能迅速發(fā)揮藥效，又能長時間維持藥效。黏膜給藥大大拓寬了許多藥物的給藥途徑，特別是一些多肽類、大分子類藥物。
2.1.1 鼻黏膜給藥 鼻黏膜是黏膜免疫系統(tǒng)的重要部分，鼻腔內(nèi)含有豐富的血管，經(jīng)鼻腔接種既可產(chǎn)生黏膜免疫又能產(chǎn)生系統(tǒng)免疫，鼻黏膜給藥因?yàn)槠湮彰娣e大，不經(jīng)過腸循環(huán)，生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，成為蛋白質(zhì)及多肽藥物的理想給藥途徑之一，如胰島素，在胃腸道中幾乎不能吸收，但卻可通過鼻黏膜、眼黏膜吸收。多年來，對于鼻黏膜給藥劑型的研究較多，如固體粉末制劑、生物黏附性微球、脂質(zhì)體等，這些新劑型突破*氣霧劑等傳統(tǒng)劑型易被鼻黏膜纖毛清除的缺陷，使藥物在黏膜停留時間長，從而達(dá)到*的目的。在對劑型改造的同時，
Kimbell等
[5]對傳統(tǒng)給藥方式也有了新的詮釋。他們研究鼻腔噴霧劑行為，用實(shí)驗(yàn)測量和計(jì)算其流體動力學(xué)并建立模型，通過了解鼻氣流中離子輸送途徑，設(shè)計(jì)更有效的噴霧，達(dá)到藥物*目的。
2.1.2 頰黏膜給藥以及口服給藥 口腔黏膜給藥具有以下特點(diǎn)：(1)口腔黏膜中的頰黏膜和舌下黏膜部位的血管密集，血流豐富，黏膜組織的通透性僅次于鼻黏膜；(2)與鼻腔給藥和經(jīng)皮給藥相比，口腔黏膜中酶的活性更低，因此可以有效地避免藥物的降解和代謝；(3)口腔黏膜具有較強(qiáng)對外界刺激的耐受性，當(dāng)黏膜組織受到制劑中的一些成分產(chǎn)生刺激性和損傷，停止用藥后能夠較好的恢復(fù)；(4)劑型易定位，用藥方便，可以隨時撤去藥物，易被患者接受[
6
]?？诜呙缡堑鞍踪|(zhì)疫苗中比較新的方法，兩種口服疫苗——薩賓口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗和Ty21傷寒疫苗在美國等地被列入疫苗接種計(jì)劃。目前，包括艾滋病、炭疽、子宮頸癌、霍亂、胃腸炎、腹瀉和瘧疾等疾病的疫苗都在嘗試口服*[7]。據(jù)報(bào)道，可溶性蛋白質(zhì)抗原當(dāng)口服給藥時可以刺激產(chǎn)生免疫[
8]?？诜鞍踪|(zhì)藥物主要采用兩條給藥路線，一是利用生物黏附(bioadhesion)原理[9]，用聚合物材料起定位“平臺”作用，通過黏膜給藥，使制劑具有局部靶向性、*性的雙重特點(diǎn)。Bernkop-Schnurch和Pasta[10]研究表明，通過殼聚糖及其衍生物與酶抑制劑的結(jié)合物降低消化酶對蛋白質(zhì)和多肽類藥物的代謝，可以大大提高胰島素口服生物利用度。二是采用保護(hù)的形式，將抗原包被起來，保護(hù)性材料可以保護(hù)藥物不受胃腸道消化酶的破壞，增加藥物與胃腸道黏膜的緊密接觸，提高生物利用度。2.1.3 肺部吸入給藥 目前對于蛋白質(zhì)藥物肺部吸入給藥的研究越來越多，很多蛋白質(zhì)藥物，如亮丙瑞林、胰島素、生長激素可以生理活性型從肺部吸收，生物利用度超過胰島素與生長激素不加促進(jìn)劑鼻腔給藥系統(tǒng)的生物利用度。Norwood
等[11]
指出，與皮下胰島素注射相比，吸入性人胰島素(Exubera)可提供血糖控制，并且對肺功能只有輕度、可逆的作用，可替代胰島素注射給藥。肺部給藥已取得重大進(jìn)展，現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。黏膜給藥系統(tǒng)延長藥物在吸收部位的滯留時間，使藥物與黏膜上皮緊密接觸，改善黏膜上皮吸收差的藥物(如蛋白質(zhì)多肽類藥物)的吸收情況，提高生物利用度，還有一些生物黏附性聚合物具有抑制蛋白水解酶的作用，為蛋白質(zhì)藥物給藥開辟新的途徑，近年來已引起人們的廣泛關(guān)注和重視。
2.2 透皮給藥系統(tǒng)(transdermal
therapeutic system，TTS；transdermal delivery
system，TDS)
透皮給藥系統(tǒng)是指在皮膚表面*傷給藥，藥物以恒定的速度通過皮膚進(jìn)入體循環(huán)，產(chǎn)生全身或者局部治療作用。透皮給藥系統(tǒng)很有前景，相關(guān)制劑已經(jīng)發(fā)展成為數(shù)十億美元的工業(yè)?；颊哌x擇透皮制劑因?yàn)樗姆奖悖翰恍枰磿r服用，也沒有任何痛苦，并且可隨時中斷用藥；因?yàn)樗鼈兊墓π?，這些制劑同樣受到醫(yī)生們的歡迎：它可以避免口服藥產(chǎn)生的并發(fā)癥、低吸收率、胃腸道酶對藥物的降解作用以及注射方式帶來的血藥濃度的峰谷現(xiàn)象，尤其解決了蛋白質(zhì)和多肽藥物在體內(nèi)易被降解和半衰期短的問題。透皮給藥zui大障礙是皮膚角質(zhì)層的阻礙，Chen等[12]，用一種基于噬菌體展示的新的高通量的篩選方式，從數(shù)以百萬計(jì)的多肽中找到一種伴侶，它可運(yùn)送蛋白質(zhì)通過皮膚，并發(fā)現(xiàn)一個*的序列，并在動物模型中得到證明；它能夠顯著增加胰島素和人生長激素的透皮運(yùn)輸，不同于以往物理和化學(xué)的方法。Chen
等[12]采取生物的方法增加皮膚的通透性，并應(yīng)用于胰島素和它們的多肽的復(fù)合物，增加了大鼠血漿的胰島素水平，降低了血糖水平。透皮運(yùn)送的人生長激素同樣增強(qiáng)，這說明該方法可廣泛適用。這種分子伴侶使得蛋白質(zhì)藥物透皮給藥系統(tǒng)的有了激動人心的發(fā)展。
2.3 緩控釋技術(shù)(controlled
release drug delivery
system)在蛋白質(zhì)藥物注射給藥系統(tǒng)中，常采用以鑲嵌(entrapment)和包囊(encapsulation)為主要方法的緩控釋技術(shù)，包括聚合體給藥系統(tǒng)(
水凝膠、納米膠囊、微球體等)和脂類基礎(chǔ)的給藥系統(tǒng)(脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒等)
。緩控釋給藥可減少給藥次數(shù)，注射后患者血藥濃度穩(wěn)定，在體內(nèi)作用時間長，從而增加藥物*性。水凝膠是交聯(lián)的親水聚合物，通過形成三維網(wǎng)絡(luò)，對pH、離子強(qiáng)度、溫度等生理性刺激的應(yīng)答有一定比例的降低[13]，這些都有助于蛋白質(zhì)釋放的控制。水凝膠物質(zhì)可以作為微球給藥，或者在原位組成給藥系統(tǒng)。原位組合系統(tǒng)與傳統(tǒng)的微球有許多優(yōu)勢，給藥方便，復(fù)雜性和潛在危險(xiǎn)低，在制藥條件方面更適合蛋白質(zhì)這樣的敏感藥物分子[14]。Bako等[15]將納米復(fù)合材料的生物相容性水凝膠(NCHG)，作為局部給藥裝置，用于牙周感染的原位給藥。在水溶液中，納米粒子被自由原子捕獲，引起單體、2
- 羥乙酯(HEMA)和聚乙二醇二甲基(PEGDMA)的共聚作用，由光聚合交聯(lián)在一起。之后藥物被包入納米粒子，通過溶脹行為釋藥。研究發(fā)現(xiàn)，一般藥物釋放是在24h
內(nèi)，但是NCHG 對藥物釋放期超過48h，達(dá)到*目的。
3 定點(diǎn)突變和化學(xué)修飾治療用蛋白質(zhì)的*性可以通過多種方式的化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)。例如，通過突變一個或者多個氨基酸(就是創(chuàng)造一個蛋白質(zhì)類似物)或者通過糖基化、?；騊EG化修飾。這些修飾可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝動力學(xué)特征，但同時，蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性也會改變，所以要十分小心。
3.1 定點(diǎn)突變(site-specific
mutagenesis)
人α 干擾素( hIFN-α)提供了一個很好的例子。hIFN-α
是與阻止病毒感染密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，它可以抑制細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。重組hIFN-α2已被證明可有效治療各種人類病毒性疾病和癌癥。然而，由于其體循環(huán)半衰期短，在一段較長時期內(nèi)必需頻繁給藥。Ceaglio
等[16]利用糖基化策略進(jìn)行定點(diǎn)突變。將一段N-糖基化共有序列插入到干擾素的不同位置，構(gòu)成4N 和5N-
干擾素變異體，其大小和帶電量等因素增加，減輕了腎臟對干擾素蛋白質(zhì)的清除。藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)同時顯示了4N 和5N- 干擾素變異體，與非糖化hIFN-α2
相比，其半衰期增長了25 倍，全身清除率下降到原來的1/20。此外，靜脈注射接種后，4N 類似物無論是在分布還是半衰期，都是非糖化干擾素的11
倍。由此可見定點(diǎn)突變技術(shù)可顯著改善蛋白質(zhì)藥物的藥代動力學(xué)性能，延長半衰期。重組人類白介素-2(IL-2)是另一個例子，它的療效是通過基因重組設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的。市售非糖IL-2
類似物阿地流津(aldesleukin)是一種人IL-2 脫酰類似物，其中125 位上的半*被*取代。實(shí)驗(yàn)用IL-2 類似物BAY
50-4798(Bayer)是另一種遺傳工程蛋白質(zhì)，它潛在地提高了IL-2
的*性。
3.2 糖基化修飾(Glycosylation)蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，已有越來越多的藥用重組蛋白被制備，它們多屬于糖蛋白，如重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)、重組人組織纖溶酶原激活劑(rhtPA)等。蛋白質(zhì)表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動力學(xué)作用、生物活性、穩(wěn)定性、對蛋白酶的易感性、水溶性、凝集性、免疫原性等。對于治療性蛋白質(zhì)，糖基化形式與非糖基化形式相比，可增加血清半衰期，并且糖基化蛋白質(zhì)對蛋白酶水解作用較不敏感，也具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。用基因工程手段對TNK組織纖維蛋白溶酶原激活劑分子進(jìn)行糖基化修飾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，修飾后的蛋白質(zhì)具有更長的半衰期，并且在急性心梗治療中可以采用低劑量單次快速注射[17]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞生長的細(xì)胞因子[18]。EPO
是一個高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，由165 個氨基酸組成，其成分約有60%蛋白質(zhì)和40%糖(重量百分比)。EPO 含3 個N- 糖鏈和1 個O-
糖鏈。研究表明，EPO 的糖基化不影響其體外生物學(xué)活性，但卻可延長體內(nèi)半衰期。由此，Amgen 公司的科學(xué)家合成了一種新型的促紅細(xì)胞生成蛋白(novel
erythropoiesis stimulating protein，NESP)。與EPO 相比，NESP 在33 和88位各增加了1 個N-
糖基化位點(diǎn)。NESP 的體內(nèi)半衰期是EPO的3
倍，從而達(dá)到了減少用藥次數(shù)的目的。
3.3 聚乙二醇化修飾(PEGylation)
通常，PEG修飾通過減少代謝和體循環(huán)中受體介導(dǎo)的對蛋白質(zhì)的吸收，達(dá)到降低血漿清除率。PEG修飾同時通過保護(hù)性抗原和免疫原也增加了安全性[19]。我們必須了解，PEG
多聚體由許多不同的分子聚合而成，另外，大分子蛋白質(zhì)中還有很多可以結(jié)合PEG的位點(diǎn)。所以無論從效率還是從安全的觀點(diǎn)，由于這種潛在的產(chǎn)物的異質(zhì)性，PEG
修飾需要進(jìn)行優(yōu)化，其中，PEG 定點(diǎn)修飾是近年來比較熱門的方法。2006 年，申請美國的PEG 化粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)[20]和PEG
化白細(xì)胞介素-10 (PEG-IL-10)[21]便是N端氨基定點(diǎn)修飾產(chǎn)物。急性腹腔注射膽囊收縮素( CCK ) 可誘發(fā)顯著的厭食癥，
但這種藥物持續(xù)時間短。因此，Verbaeys 等[22]利用膽囊收縮素與相對分子質(zhì)量為10 000
的聚乙二醇共價配對，形成共軛產(chǎn)物PEGCCK9，然后對其藥物代謝方面做了詳細(xì)的記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG-CCK9 比未經(jīng)修飾的CCK9
有著顯著*的厭食癥癥狀。Na 等[23]選用mPEG-SPA 和mPEG- 丁醛(mPEGsuccinimidyl
butyraldehyde)修飾奧曲肽(Octreotide)，其中mPEG- 奧曲肽在體內(nèi)的半衰期提高了2
倍，而且mPEG-丁醛修飾產(chǎn)物在制備微球過程中有很好的防PLGA(乳酸/
羥乙酸共聚物)酰化作用。
3.4 ?；揎?Acylation)
在一些例子中，脂肪酸這樣的化學(xué)連接物通過在蛋白質(zhì)表面暴露殘基可增加蛋白質(zhì)與血清白蛋白的親和力，從而增加它在血液中的循環(huán)時間。?；瘜τ谛〉鞍缀投嚯母行В?yàn)樗鄬Ω蟮脑黾恿说鞍踪|(zhì)的疏水性。例如，?；艘葝u素類似物(B30
酰基化)相較于地特胰島素(insulin
detemir)更加*，并且在一些國家已經(jīng)通過監(jiān)管部門的認(rèn)可。?；脑硪餐瑯映晒Φ剡\(yùn)用到了其他蛋白的構(gòu)建上，如胰高血糖素樣肽1(GLP1)和干擾素α，以及*(*)。然而，?；葝u素和GLP1
是位點(diǎn)特異的，而干擾素的?；筒荒敲刺禺?。
4 蛋白質(zhì)和多肽藥物的前景
由于人們對藥物安全及毒副作用的關(guān)注，基因工程藥物的研究也越來越受到重視。經(jīng)過20多年的努力，我國的基因工程藥物取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。近年來，隨著多肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的不斷明確，很多蛋白質(zhì)和多肽藥物被研制出來并且進(jìn)入臨床階段，但是蛋白質(zhì)和多肽藥物半衰期短，需頻繁給藥，在生理和心理上對患者造成*負(fù)擔(dān)；而蛋白質(zhì)和多肽藥物的*性的研究不但解決以上問題，而且使一些由于半衰期短而無法進(jìn)入應(yīng)用的藥物獲得很好的治療效果，所以，蛋白質(zhì)及多肽藥物的研制有著廣泛的前景。
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