低鹽度下凡納濱對蝦脂肪營養生理研究
凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是世界三大主要養殖蝦類之一,雖然是海水品種,但對鹽度變化的適應能力*。因此,凡納濱對蝦的淡化養殖已成為世界各地內陸養殖的一大亮點。在我國,凡納濱對蝦的低鹽度養殖也在全國范圍如火如茶地開展。目前,我國凡納濱對蝦淡化養殖產量已超過70萬噸,基本上與海水/半咸水養殖產量持平,成為我國內陸水生動物養殖的支柱產業之一。但是淡化養殖過程中,對蝦生長速度低、成活率低和抗逆性差的"三低現象"依然存在,嚴重影響了凡納濱對蝦的品質及產量。盡管凡納濱對蝦對鹽度的適應力較強,因其是海水品種,低鹽度的養殖條件對該蝦的生長和發育始終是一種環境脅迫。對于任何一種動物,*處于脅迫條件下,機體必然會產生若干不適,嚴重時甚至會發生死亡現象。所以,如何緩解低鹽度脅迫對凡納對蝦的應激,是解決當前對蝦養殖產業中現存問題的一個重要問題,查明并掌握其滲透壓調節機理及鹽度與機體生理功能的關系是解決以上難題的關鍵。本研究采用多種營養調控手段,較系統地研究了脂肪營養對凡納濱對蝦在低鹽度下生長、存活和脂類代謝等方面的影響,并探討了脂類代謝在對蝦滲透壓調節過程中的重要作用及調節機制。論文的主要結果和結論如下:1、鹽度對凡納濱對蝦生長、存活和脂肪代謝的影響以及轉錄組學分析選取初始體重為(1.98 ±0.28g)的大小均勻、活力相當的凡納濱對蝦,在3種鹽度(3、17和30psu)下用商用飼料飼養殖8周,通過測定對蝦生長性能、不同組織中脂肪酸組成及脂肪代謝過程中的關鍵酶和生化物質,并對3和30 psu處理組的肝胰臟進行了轉錄組分析(RNA-seq)。結果發現,各處理組對蝦體成分(粗蛋白、粗脂肪、水分、灰分)無顯著性差異。低鹽度組(3 psu)的凡納濱對蝦的存活率和增重率都顯著低于中、高鹽度組(17 psu和30 psu)。此外,低鹽度組凡納濱對蝦肝胰臟中亞麻酸(C18:3n-3)和n-3系長鏈高不飽和脂肪酸(n-3LC-PUFA)的含量,以及肌肉中 EPA(C20:5n-3)、DHA(C22:6n-3)和n-3 LC-PUFA)均顯著高于其他組。同時,在各處理組中均檢測到脂肪酸合成酶(FAS)、激素敏感脂肪酶(HSL)、脂蛋白酯酶(LPL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT2)、超長鏈脂肪酸延伸酶(ELOVL6)、△5脂肪酸去飽和酶(△5FAD)以及△6脂肪酸去飽和酶(△6FAD)的活力,并且以上脂肪代謝相關酶隨著鹽度降低均呈現出先降低后升高的趨勢,但各組并無顯著性差異。在轉錄組分析結果中,共獲得了 26,034個基因,其中855個基因在低鹽度下發生了顯著的變化。18條顯著變化的KEGG通路中以生理反應為主,主要與脂類代謝相關,包括脂肪酸合成、花生四烯酸代謝、鞘糖脂和粘多糖代謝。脂類或脂肪酸能通過為鰓供應能量或參與細胞膜的構建,從而減輕鹽度變化的脅迫,維持機體滲透壓平衡。所有實驗結果表明,低鹽度環境脅迫會抑制凡納濱對蝦生長,該條件下凡納濱對蝦對n-3HUFA需求量增大,提示提高飼料中n-3HUFA含量可能有助于緩解低鹽度脅迫,提高對蝦的生長速度。另外本研究還報道了*低鹽度脅迫下凡納濱對蝦轉錄組的響應機制,該結果為進一步研究廣鹽性物種的滲透壓調節機制奠定了重要的基礎。2、低鹽度下不同脂肪源對凡納濱對蝦生長性能和脂肪代謝的影響以及轉錄組學分析選取初始體重為(1.98±0.28g)的凡納濱對蝦,在低鹽度(3psu)下,分別用豆油(SO)、牛油(BT)、亞麻籽油(LO)、魚油(FO)、亞麻籽混合油(SBL)(SO:BT:LO = 1:1:1)、魚油混合油(SBF)(CO:BT:FO = 1:1:1)六種飼料飼養 8周。結果顯示,SBL組增重率、存活率均高于其它處理組,SBL組的粗脂肪顯著高于SO和LO組。肌肉中脂肪酸積累量,在各組中,均檢測到DHA、EPA等n-3 HUFA的存在,同時SBL組中亞麻酸(C18:3n-3)積累量顯著高于SO、BT、FO、SBF組。此外還檢測到脂肪酸去飽和酶5和6(FAD5和FAD6)以及脂肪酸超長碳鏈延長酶6(ELOVL6)的活力,且BT組的酶活力顯著高于其他組。同時還對BT、FO、SBL三個處理組的肝胰臟進行了轉錄組測序。測出的核酸序列中有 17,232(76.83%)、6298(28.08%)、3720(16.58%)和 302(1.35%)條序列分別注釋到NR、string、KOG、COG和NOG中。KEGG富集性分析結果顯示,共9621條基因注釋到316條通路中,其中兩兩比較的結果顯示(BT-FO、BT-SBL和FO-SBL)分別有32、42和39條通路發生了顯著性變化。結果表明,飼料中不同的脂肪源的影響主要是由于其脂肪酸的組成不同所致,脂肪酸能為凡納濱對蝦滲透壓調節提供能量或調節細胞膜的滲透性。飼料中適當添加n-3 HUFA能顯著提高凡納濱對蝦適應低鹽度脅迫的能力,但過多的PUFA和n-3 HUFA反而不利。另外,研究結果還提示凡納濱對蝦在低鹽度下可能具有一定的合成n-3HUFA的能力。3、不同鹽度下高不飽和脂肪酸水平對凡納濱對蝦的滲透壓調節和生長性能的影響通過在高、低兩種鹽度下添加不同飼料魚油和椰子油水平,探究不同高不飽和脂肪酸對凡納濱對蝦在高低鹽度下滲透壓調節的影響。選取初始體重為(1.89± 0.16g)大小均勻、活力相當的凡納濱對蝦,分別在3 psu和30psu鹽度下飼喂魚油、椰子油和混合油(魚油:椰子油=1:1)為油源的飼料。生長數據的結果表明,在高鹽度環境中各飼料組之間的存活率并沒有顯著差異,但高鹽度處理組均顯著高于其對應的低鹽度處理組。在低鹽度環境中,魚油處理組的存活率,混合油處理組其次,而椰子油處理組低。高鹽度處理組的增重率均顯著高于低鹽度處理組。在低鹽度環境中,增重率隨著飼料魚油含量增多而顯著升高。而在高鹽度環境中,混合油飼料組的增重率顯著高于其它組。此外,凡納濱對蝦肝胰臟和鰓中高不飽和脂肪酸的含量隨著飼料魚油含量的增加而增加。Na~+/K~+-ATPase和總ATPase的酶活力在高鹽度環境下隨著飼料魚油含量的增加而降低,而在低鹽度環境中兩種酶在混合油(50%魚油)處理組中活力低。另一方面,Na~+/K~+-ATPase和總ATPase的mRNA的水平與酶活力呈負相關。結果表明,飼料中的魚油在凡納濱對蝦應對鹽度壓脅迫和維持滲透壓平衡時起著積極的作用,然而在高鹽度下,混合油飼料組卻呈現出更高的生長率和滲透壓調節能力。這說明飽和脂肪酸能與高不飽和脂肪酸協同可提高滲透壓調節能力,并且比單一的高不飽和脂肪酸有更好的效率。4、不同鹽度下亞麻酸水平對凡納濱對蝦的脂肪代謝和高不飽和脂肪酸合成的影響通過在高、低兩鹽度下添加不同飼料水平的紫蘇油和椰子油,探究了不同αα-亞麻酸對凡納濱對蝦在高低鹽度環境中滲透壓調節的影響。實驗選取初始體重為(1.89±0.16g)大小均勻、活力相當的凡納濱對蝦,分別在3psu和30psu鹽度下飼喂紫蘇油、椰子油和混合油(紫蘇油:椰子油=1:1)為油源的飼料。各脂肪源處理組在低鹽度下的存活率和增重率顯著低于其高鹽度處理組。高鹽度環境中,各脂肪源處理組之間的存活率沒有差異,但在低鹽度下混合油和紫蘇油處理組存活率顯著高于椰子油處理組。在低鹽度下,增重率隨飼料紫蘇油含量的增加而升高,而在高鹽度環境下則是混合油處理組顯著高于紫蘇油處理組。另一方面,鰓組織中的高不飽和脂肪酸在兩種鹽度下均呈現隨飼料紫蘇油增加而顯著遞增的趨勢。而低鹽度下混合油和紫蘇油處理組中的肝胰臟中α-亞麻酸顯著低于其高鹽度處理組。Na~+/K~+-ATPase的酶活力在高鹽度環境下隨著飼料紫蘇油含量的降低而降低,但在低鹽度環境下混合油(50%紫蘇油)處理組酶活力低。這些結果說明在低鹽度脅迫下,添加紫蘇油能顯著提高凡納濱對蝦的滲透壓調節的能力,并促進對蝦的生長。且低鹽度可能會刺激凡納濱對蝦利用αα-亞麻酸來生物合成高不飽和脂肪酸,并運送至鰓組織并參與細胞膜的構成而提高了機體的滲透壓調節能力。5、不同鹽度下脂肪源對凡納濱對蝦滲透壓調節及其血清代謝組學分析的影響采用核磁共振光譜法(Nuclear magnetic resonance spectroscopy)從代謝組學層面解析不同鹽度與不同脂肪源對凡納濱對蝦的影響。在兩種環境鹽度(3 psu和30 psu)下分別使用富含高不飽和脂肪酸的魚油(FO)、富含亞麻酸的紫蘇油(PO)和富含飽和飽和脂肪酸的椰子油(CO)為油源的飼料飼喂凡納濱對蝦,并分別在低鹽度(3 psu)下和高鹽度(30 psu)下對不同脂肪源飼料組的差異代謝物進行兩兩比較,以及比較同一脂肪源飼料組在不同鹽度處理下的差異代謝物,探究這三種不同脂肪酸構成的脂肪源對凡納濱對蝦鹽度適應過程中的影響。所獲得顯著變化的差異代謝物可以大致分為三大類:氨基酸、碳水化合物和脂類。但處于低鹽度環境時,CO處理組中*和*的含量顯著高于其它組,且FO處理組含量低。同時PO處理組中油酸和葡萄糖的含量,其次是CO處理組,而FO處理組低。然而,但凡納濱對蝦處于高鹽度環境時,PO處理組的*和賴氨酸的含量,CO處理組次之,FO處理組低;而棕櫚酸、油酸和磷酸甘油在CO處理組中的含量,PO處理組次之,FO處理組低。另一方面,相比于高鹽度環境凡納濱對蝦在面對低鹽度脅迫時,CO和FO處理組在低鹽度環境中,*和*的含量顯著高于高鹽度環境,*的含量呈相反趨勢;而在PO處理組中,*的含量顯著降低了。這一結果說明,在遭遇鹽度脅迫時,不同的脂肪在鹽度脅迫下參與滲透壓調節的同時,不僅能通過提供能量、調節細胞膜的流動性和滲透性來緩解鹽度的脅迫,同時還參與血液中氨基酸比例與構成的調節來保持體內離子的平衡,從而更加有效的維持機體的滲透壓平衡和生理狀態。6、凡納濱對蝦A6脂肪酸去飽和酶基因與鹽度及飼料營養脂肪關系的研究研究獲得了 A6脂肪酸去飽和酶(△6fattyacyldesaturase)基因的全長,該基因共計 1491 bp,包括 39 bp 的 5’-UTR、108 bp 的 3’-UTR 和 1344 bp 編碼 448個氨基酸的開放閱讀框架(openreadingframe)。該基因所翻譯的蛋白質經過分析和鑒定,主要包含一個細胞色素b5血紅素/類固醇的結合結構域和一個脂肪酸去飽和酶結構域。凡納濱對蝦的△6脂肪酸去飽和酶與其他甲殼動物該基因的具有70%-77%的序列同源性,如:日本沼蝦Macrobrachium nipponens、擬穴青蟹Scylla paramamosain三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus和中華絨螯蟹Eriocheir sinensis。當環境鹽度從30 psu降低到3 psu時,凡納濱對蝦A6脂肪酸去飽和酶基因的表達量在鰓、眼柄和肝胰臟中顯著升高。而在3 psu低鹽度下,檢測到△6脂肪酸去飽和酶在亞麻籽油處理組的肝胰臟中表達量,魚油處理組次之。結果表明,凡納濱對蝦具有編碼△6脂肪酸去飽和酶的基因,并且該基因的表達量隨著鹽度的降低而升高,并與C18脂肪酸(例如:α-亞麻酸和*)的含量有關。本研究揭示了鹽度和飼料脂肪對該基因的影響,為海洋廣鹽性對蝦的A6脂肪酸去飽和酶基因的研究提供了的借鑒。
