如何獲得高的大腸桿菌感受？
關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，zui復(fù)雜的莫過于電轉(zhuǎn)化，而zui簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。
現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率zui高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，的莫過于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數(shù)生長已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6，0.8等等。同時(shí)，OD值大時(shí)菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點(diǎn)，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了Inoue的感受態(tài)制備方法，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。
7、此外文獻(xiàn)報(bào)道，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。
8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此*用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱，這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn)，只是一種感覺，*次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。
影響感受態(tài)的形成還有許多原因，如菌株等，由于沒有以這一方面的經(jīng)驗(yàn)，希望大家補(bǔ)充。
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