細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及回答

細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及回答 

如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 

培養(yǎng)某一類(lèi)型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。 

L-*在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ 

L-*在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-*可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有zui終定論。L-*的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。 

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-*的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-*來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-*供利用。 

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-*幾乎*降解。 

什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 

酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 

如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？ 

用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。 

如何消除組織培養(yǎng)的污染？ 

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。 

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如*和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是*的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 

1. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 
2. 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，**下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 
3. 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 
4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。
5. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 
6. 重復(fù)步驟4。 
7. 在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。 


培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

目錄上說(shuō)，Hank's *(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's *(HBS)和Earle's*(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ 

HBS和 EBS 的主要差別在于*的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。*需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。 

二價(jià)離子抑制*活性嗎？使用*時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 

二價(jià)離子的確抑制*活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制*的活性。建議*處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。 

我試用SF900 II時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好。 

如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。 

20°C下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎？ 

對(duì)于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。 

下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況： 

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-(2x0.310)＝6.78 

緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃ 

Mes 6.15 -0.110 
Ada 6.60 -0.110 
Pipes 6.80 -0.085 
Aces 6.90 -0.200 
Bes 7.15 -0.160 
Mops 7.20 -0.013 
Tes 7.50 -0.200 
Hepes 7.55 -0.140 
Tricine 8.15 -0.210 
Tris 8.30 -0.310 
Bicine 8.35 -0.180 
Glycylglycine 8.40 -0.280 


室溫下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？ 

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。 

4°C 25°C 37°C 
8.1 7.5 7.2 
8.2 7.6 7.3 
8.3 7.7 7.4 
8.4 7.8 7.5 
8.5 7.9 7.6 
8.6 8.0 7.7 
8.7 8.1 7.8 
8.8 8.2 7.9 
8.9 8.3 8.0 
9.0 8.4 8.1 
9.1 8.5 8.2 
9.2 8.6 8.3 
9.3 8.7 8.4 
9.4 8.8 8.5 


昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的zui適PH值和滲透壓是多少？ 

生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系，在PH值 6.0～6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的zui適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。 

High Five細(xì)胞有任何其它名稱(chēng)嗎？ 

High Five細(xì)胞也被稱(chēng)為T(mén)richoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 

PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別 

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用，PFHM-II可能需要補(bǔ)充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基，也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。 

在High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？ 

High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 

High Five細(xì)胞用多大的密度凍存？ 

3.0x10E6 cells/ml。 

在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對(duì)我的細(xì)胞有害嗎？ 

可能是*沉淀，但是更可能是L-*沉淀。培養(yǎng)基中*的濃度比典型的2mM高6倍。*的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比*更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。 

如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用*消化嗎？ 

我們強(qiáng)力*使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性zui小，生活力zui高。正如手冊(cè)上所顯示，通過(guò)使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下，才使用*消化細(xì)胞。 

*消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞： 1. 去除培養(yǎng)基。 
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。 
3. 加入2ml 1x*EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。 
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。 
5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了*的活性。） 
6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。 
7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。 


在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？ 

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。 

在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？ 

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò)95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。 

Tech tips 

● 貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周?chē)腃O2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來(lái)校正溶液的pH值（確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換）。 

● 如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。 

● 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 

● 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。 

● 總之，大部分添加物和試劑zui多可以?xún)鋈?次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。 

● 在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，我們強(qiáng)烈*進(jìn)行臺(tái)盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的稀釋?zhuān)?∶4或1∶2）進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測(cè)，您可能接種比你認(rèn)為的低的多的濃度的細(xì)胞，這常常可能導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢或培養(yǎng)物根本不生長(zhǎng)。 

● 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體*溶液。*在4℃就可能開(kāi)始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。