Western Blot條件的摸索
DDD.用的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過(guò)一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒(méi)問(wèn)題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的較少。難道是裂解液出了問(wèn)題？我用的是三去污劑，但沒(méi)加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問(wèn)題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來(lái)講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒(méi)問(wèn)題，哪就看是不是電泳的問(wèn)題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過(guò)積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。
3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說(shuō)的大蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌佟Ｎ以?jīng)也轉(zhuǎn)過(guò)2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。
4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣*，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長(zhǎng)1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過(guò)夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取?br />6、我買(mǎi)的也是Santa Cruz的抗體，我覺(jué)得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。
EEE.電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。
解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80－100伏。
FFF.BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有一個(gè)很致命的弱點(diǎn)就是無(wú)法控溫（我用的就是這種），當(dāng)電流過(guò)高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。
就轉(zhuǎn)膜時(shí)，是采取恒壓還是恒流的問(wèn)題，我想和大家探討一下，我感覺(jué)我這個(gè)系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來(lái)轉(zhuǎn)膜，剛開(kāi)始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開(kāi)始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？
解答：恒流時(shí)電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺(jué)，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過(guò)我用的是小膠40cm2，不知有無(wú)不同。
GGG.我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不*（電壓過(guò)小時(shí)間過(guò)短）或過(guò)度轉(zhuǎn)移（電壓過(guò)大時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）的問(wèn)題，魚(yú)（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，下半時(shí)間短，上半時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，應(yīng)該會(huì)好一些。
HHH.請(qǐng)問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。
III.1、煮好后的樣品，若沒(méi)有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒(méi)有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒(méi)有操作手冊(cè)？3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是否必須要用bio-rad的濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因?yàn)槲乙蛛x小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個(gè)濃度？書(shū)上寫(xiě)不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍了？
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁(yè)Bio-Rad USA上有。
3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。
JJJ.怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定的條件？
解答：隨便說(shuō)一點(diǎn)， 具體的還是需要自己想：
1、在每個(gè)上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，是組織樣，（也可以跑1 個(gè)大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-page；
2、轉(zhuǎn)移， 設(shè)定電流或電壓；
3、每隔 1（or n） 小時(shí)，取一點(diǎn)膜染色，看轉(zhuǎn)移效果。
KKK.我要測(cè)兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip，我用*（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒(méi)什么效果？
解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。
LLL.1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復(fù)合物時(shí)，每次要重懸多長(zhǎng)時(shí)間合適？2、zui后用2xSDS重懸抗原-抗體復(fù)合物離心后，由于2XSDS中已經(jīng)加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時(shí)也不知道里面是否吸進(jìn)了Agarose。不知有什么方法可以解決這個(gè)問(wèn)題，或者即使吸進(jìn)了一些Agarose也不要緊呢？
解答：1、不用重懸多久，重懸起來(lái)了就可以離心了。
2、加2X BUFFER前大體上已經(jīng)知道有多少膠粒了，吸到那個(gè)位置時(shí)小心點(diǎn)就是了。我也試過(guò)一些次，首先離心稍微長(zhǎng)一點(diǎn)，長(zhǎng)20秒吧，希望膠粒能沉得結(jié)實(shí)點(diǎn)（我想象的），再吸取。如果感覺(jué)槍頭不是很順暢的時(shí)候可能就是碰到膠粒了。很難一點(diǎn)膠粒也吸取不上來(lái)的，盡力做好就是了。
MMM.磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。我做的時(shí)候從未加過(guò)，都做出來(lái)了。
NNN.Western Blot中block的zui短時(shí)間?
解答：每一步1小時(shí)足夠了， 中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時(shí)間10分鐘就夠，洗3次只要半小時(shí)。跑膠1小時(shí)， 轉(zhuǎn)移1小時(shí)，block半小時(shí)就行，1抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，2抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色， 一塊western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。
OOO.想用Western檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對(duì)小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件？
解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對(duì)于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間，
2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.
3、transfer buffer 中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分離膠.
PPP.蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請(qǐng)問(wèn)多大電流，多長(zhǎng)時(shí)間比較合適？
解答：分子量比較小，是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過(guò)了。干轉(zhuǎn)的話，用2.5 A/cm2， 30min就應(yīng)該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照bio-rad的說(shuō)明，用100mA，也得要半個(gè)多小時(shí)吧。
Q.需要測(cè)同一種蛋白質(zhì)的總量與磷酸化的量，但相互間干擾太大，怎么辦？
解答：將膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巰基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分鐘，TTBS西三次，再重新加入一抗，進(jìn)行另一種抗原的檢測(cè)。
RRR.做Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)膜時(shí)的電流總是偏小，轉(zhuǎn)膜的效率也偏低. 100V恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)的電流只有190mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一樣，只是環(huán)境溫度比以前低了很多。
解答：有可能重復(fù)使用了轉(zhuǎn)移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來(lái)越大，當(dāng)然恒壓時(shí)電流越來(lái)越小了。建議更換轉(zhuǎn)移緩沖液。反復(fù)使用不要超過(guò)三次。環(huán)境溫度低是有利于轉(zhuǎn)移的。
SSS.我電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。一抗我買(mǎi)的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應(yīng)該出條帶呀！細(xì)胞用三去污劑裂解的，沒(méi)有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？
解答：1、建議您用恒壓進(jìn)行電泳，先用70V，等跑過(guò)積層膠與分離膠的界*，換用90-100V，再跑3小時(shí)左右。2、轉(zhuǎn)膜可用恒流，但要根據(jù)你的膜的面積及所要檢測(cè)的蛋白的分子量的大小來(lái)確定電流的大小，一般來(lái)講，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的電流大些，譬如，你膜的面積是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的條件進(jìn)行，你就可以60mA的電流進(jìn)行。3、我覺(jué)得你的抗體應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我們實(shí)驗(yàn)事都是保存在-20度的，提出蛋白分裝保存在-20度。
TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細(xì)胞中mRNA表達(dá)不高，估計(jì)將培養(yǎng)上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測(cè)不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時(shí)分別管制三層凝膠，分離膠用40％T丙稀酰胺（2.6％C）濃度為16.5％，另外兩層都用30％丙稀酰胺，中間一層濃度為10％，積層膠濃度為4％，凝膠厚度1mm，轉(zhuǎn)膜的條件試過(guò)30V70分鐘，膜上可見(jiàn)到小分子蛋白marker的條帶，似乎見(jiàn)到目的條帶，上樣量為60μg細(xì)胞胞漿總蛋白，轉(zhuǎn)膜的條件怎么樣合適？
解答：一定要用0.2μm的膜，并且轉(zhuǎn)移的條件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)器材來(lái)定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應(yīng)的分子量大小的marker轉(zhuǎn)移的好就可以了。
UUU.怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應(yīng)該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會(huì)跑的好些?還有前面有人說(shuō)電泳液平玻璃板會(huì)使電泳條帶漂亮些?
解答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：1、電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。
VVV.為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?
解答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，會(huì)透過(guò)膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過(guò)去了。
WWW.上次轉(zhuǎn)染了1.6*106細(xì)胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進(jìn)分離膠，在100v電泳至溴酚蘭出膠，biorad半干轉(zhuǎn)PDVF膜，15v轉(zhuǎn)30分鐘，預(yù)染marker全部進(jìn)膜，轉(zhuǎn)移后的膠考馬斯亮蘭染，可見(jiàn)殘留的蛋白條，大分子量多些.blot時(shí)，封閉用5%奶粉TTBS 1小時(shí)，抗體稀釋液TTBS，一抗(1:10，單抗上清，2000年制備)1小時(shí)，二抗(1:2000)1小時(shí)，均在室溫.結(jié)果，50kd的小分子顯色，160kd大分子未顯色。
原因分析及準(zhǔn)備改進(jìn)：轉(zhuǎn)染大容量的質(zhì)粒(融合蛋白的質(zhì)粒)的效率會(huì)相對(duì)較低，大分子量表達(dá)也會(huì)相對(duì)較低，加上大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移不*，可能是我沒(méi)有拿到大分子量條帶結(jié)果的原因。另外背景稍微有一些臟(背景整體均勻一致)，估計(jì)是二抗的濃度高了些，準(zhǔn)備降至1:5000，另外抗體稀釋液準(zhǔn)備改用5%奶粉TTBS，封閉改為室溫2小時(shí)。這個(gè)過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題？
解答：首先分析你的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。我發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)比較大的毛病：
1、一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。
2、“biorad半干轉(zhuǎn)PDVF膜，15v轉(zhuǎn)30分鐘”，你是這么做的嗎？因?yàn)槲掖蟛糠謺r(shí)間是做的恒流轉(zhuǎn)移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd轉(zhuǎn)2小時(shí)。到zui后電壓會(huì)升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉(zhuǎn)30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉(zhuǎn)上去。我建議你能將時(shí)間延長(zhǎng)，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。有時(shí)候你的marker也有可能欺騙你，因?yàn)閙arker的量比較大，是很容易轉(zhuǎn)上去的，實(shí)際上目標(biāo)蛋白的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于marker量。
我對(duì)你的結(jié)果分析如下：
1、你的結(jié)果很好，估計(jì)離目標(biāo)不遠(yuǎn)了，很快就可以成功。
2、 沒(méi)有160kd的帶是因?yàn)槟愕霓D(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)短，適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間（我懷疑這是主要的問(wèn)題）。
3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景會(huì)低一點(diǎn)。
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