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緩沖液配方的常見問題

閱讀：553發(fā)布時(shí)間：2016-11-3

　　緩沖液配方的常見問題
　　
　　UU.轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉時(shí)，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？
　　
　　解答：轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調(diào)ph值，配置而成。
　　
　　VV.準(zhǔn)備做大鼠腦的WesternBlot，蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核中，請問此蛋白質(zhì)的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)，操作時(shí)如何防止去磷酸化的發(fā)生？
　　
　　解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
　　
　　WW.想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
　　
　　解答：一般來說提取時(shí)加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。
　　
　　XX.zui近作了兩次WesternBlot，不但沒陽性結(jié)果，顯色背景都沒有，電泳和轉(zhuǎn)膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內(nèi)測。2、一抗放置2年，可能效價(jià)不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、*次有不均勻背景，因?yàn)橐豢惯^夜時(shí)密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為0.1%，不會是封閉液的問題吧？
　　
　　解答：可以在下面幾個(gè)問題上找找原因。1.封閉液用5％Milk，漂洗液（washingbuffer用TBST）2.看看一抗是否能work，降到1：20。3.看看二抗是否有問題。
　　
　　YY.加甲醇的目的是什么？
　　
　　解答：加甲醇起著一定的固定作用，因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。
　　
　　ZZ.“轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBSTzui后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？
　　
　　解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),Dissolve8.8gofNaCl，0.2gofKCl，and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,AdjustthepHto7.4withHCl,AdddistilledH2Oto1L,Sterilizebyautoclaving.
　　
　　AAA.封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下?
　　
　　解答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過夜。
　　
　　BBB.實(shí)驗(yàn)室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M尿素，2M硫脲，Triton-x-1000.2ml，新鮮加入：65mMDTT
　　
　　蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkit1%(v/v)
　　
　　是用于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細(xì)胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
　　
　　改良的RIPA裂解緩沖液(Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脫氧膽酸鈉，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2μg/ml)不知對于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制劑？
　　
　　解答：做２－Ｄ不推薦使用ＮＰ－４０（因?yàn)榧词惯M(jìn)口的ＮＰ－４０也不純，，其中的雜質(zhì)會影響質(zhì)譜結(jié)果）。對于動(dòng)物細(xì)胞，其蛋白酶活性較弱（相對于組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因?yàn)?M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ構(gòu)成的變性環(huán)境已經(jīng)足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ對于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議采用分級抽提法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。ＥＤＴＡ用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的修飾，做ＷＢ無所謂，做ＭＡＩＬＤＩ時(shí)會給正確鑒定帶來麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(zhì)(在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質(zhì)起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質(zhì)的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦采用SDS，因SDS會與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致其等電點(diǎn)發(fā)生改變，如果您實(shí)在要用，終濃度降到0.1%以下。
　　
　　CCC.WesternStrippingBuffer的配方
　　
　　解答：METHOD1
　　
　　1、strippingbuffer:62.5mmol/lTrisPH6.7；100mmol/lbeta-mercaptoethanol；2%SDS
　　
　　二次發(fā)光protocol:1.strippingbuffer洗膜：50度水浴30分鐘，搖床上搖10-20分鐘。
　　
　　2、1*PBST洗：搖床上搖30分鐘。
　　
　　3、封閉，加一抗，二抗（同*次發(fā)光）
　　
　　METHOD2
　　
　　（50ml總量）：?-mercaptoethanol342μl；20%SDS5ml；Tris-ClpH6.73.125ml；加ddH2O至50ml。
　　
　　方法：將用過的膜浸入strippingbuffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時(shí)你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來再次使用了。
　　
　　該方法的優(yōu)點(diǎn)：省事，省力，省錢，符合慣例。
　　
　　METHOD3
　　
　　1、beta-metaptoethanol35ul
　　
　　2、10%SDS1ml
　　
　　3、tris(0.5M，pH6.7)625ul
　　
　　4、dH2O3.34ml
　　
　　50-55℃，30min。
　　
　　METHOD4
　　
　　strippingbuffer應(yīng)該是可以放置很久的。不過我習(xí)慣于現(xiàn)配——畢竟，加了β-mercaptoethanol以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點(diǎn)，我每次用50ml。
　　
　　METHOD5
　　
　　0.5MNaCl，0.5MHAc；室溫?fù)u床15min。
　　
　　METHOD6
　　
　　將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同*次發(fā)光），實(shí)踐證明方法*可行。
　　
　　不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。

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