如將活細胞與一定濃度的胰蛋白酶和核糖核酸酶溫育，短時間內(nèi)對細胞的形態(tài)、功能和活力幾乎沒有影響， 但壞死細胞以及細胞漿膜受到損傷的晚期凋亡細胞則可被這兩種酶降解，使用流式細胞儀分析，可通過提高光散射、核酸或蛋白質(zhì)熒光信號的閾值排除晚期凋亡細胞和壞死細胞，測定早期凋亡細胞。

【材料與試劑】

（1） 含Ca2+ 和Mg2+ 的Hanks平衡鹽溶液（HBSS）：取1份A液（160g NaCl，8g KCl，2g MgSO4 ?7H2 O，2g MgCl2 ●6H2 O，2.8g CaCl2 溶于雙蒸水，定容至1000ml）和1份B液（3.04g Na2 HPO4 ?12H2 O，1.2g KH2 PO4 ，20g葡萄糖，溶于雙蒸水，定容至1000m）與18份雙蒸水混合，調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4，高壓滅菌后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/em>

（2） 0.5%胰蛋白酶，HBSS溶解后分裝，于-20℃保存。

（3） 200mg/ml核糖核酸酶，HBSS溶解后分裝，于-20℃保存。

【操作步驟】

（1） 于4℃離心收集細胞并重新懸浮于0.2ml HBSS中， 使其濃度位106 /ml；

（2） 加入100ml核糖核酸酶，混勻，37℃作用15分鐘；

（3）加入100ml胰蛋白酶，混勻，37℃作用30分鐘；

（4） 加入含10%小牛血清的HBSS，混勻，使胰蛋白酶滅活，4℃離心，去上清；

（5） 以HBSS洗細胞一次， 收集細胞并重新懸浮于HBSS中；

（6） 按本章介紹的其他方法， 進行凋亡細胞的染色和流式細胞分析；

【結(jié)果分析】

經(jīng)過胰蛋白酶和核糖核酸酶的消化，去除了壞死的、受機械損傷的以及凋亡晚期的細胞，剩余細胞大部分是PI拒染的細胞，包括活細胞和凋亡早期的細胞。因此，本法適用于測定凋亡早期細胞以及未產(chǎn)生DNA斷裂的凋亡細胞。

【注意事項】

當欲研究活細胞的表型時，要注意選擇酶消化的zui適時間， 因為胰蛋白酶可能會使活細胞表面抗原決定簇丟失。但經(jīng)過胰蛋白酶處理的細胞，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時后，可使大部份表面抗原得以恢復。