【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp;
了解核酸、蛋白質(zhì)、糖及酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理，掌握Brachet反應(yīng)及堿性蛋白、酸性蛋白、糖原和過氧化物酶的細(xì)胞化學(xué)染色方法。 
【實(shí)驗(yàn)用品】 
一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的Hela細(xì)胞。 
二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、水浴箱。 
三、試劑pbs緩沖液(pH7.2)、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、純二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％堿性固綠、0.1％酸性固綠、0.5％硫酸銅、聯(lián)苯胺混合液、1％番紅、無水乙醇、過碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亞硫酸水、Ehrlieh蘇木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，體積比) 
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 
細(xì)胞的組織化學(xué)方法，是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。 
一、Brachet反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA 
(一)原理 
細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍(lán)綠色，呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。由此對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 
(二)方法 
l．接種Hela細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng)24～48小時(shí)，使長(zhǎng)成單層。 
2．取出蓋片，用PBS(pH7.2)輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)?nbsp;
3．放入Carnoy固定液中固定l小時(shí)。 
4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 
5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗2～3次(2～3秒鐘左右)，吸去水分。放入純丙酮中分色2～3秒鐘。 
6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒鐘。 
7．放入純二甲苯中透明5分鐘。 
8．滴一滴中性樹膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片。 
9．鏡下觀察 
（三）結(jié)果 
細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，而其中核仁被染成紫紅色（參照照片）。 
二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示 
（一）原理 
由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。 
（二）方法 
1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干。 
2. 將涂片作好標(biāo)記放在70％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。 
3．放入5％三氯醋酸中60℃30分鐘，抽提出核酸。 
4．清水沖洗多次（3分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。 
5．濾紙吸干玻片上水分。 
6. 一張片放入0.1％堿性固綠(pH8.0～8.5)中染色10～15分鐘,另一張片放入0.1％酸性固綠(pH2.0～2.5)染色5～10分鐘。 
7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。