人類基因組大規(guī)模測序已經(jīng)基本完成。但破解基因組的序列只是一個(gè)起點(diǎn)，目前多數(shù)基因的功能還不清楚，因此基因功能的研究是今后 的發(fā)展趨勢。傳統(tǒng)研究基因功能的zui有效技術(shù)之一是細(xì)胞和小鼠的基因敲除技術(shù)。但該技術(shù)存在技術(shù)復(fù)雜、周期長、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，極大地 限制了它的應(yīng)用。應(yīng)用物理和化學(xué)突變技術(shù)可以誘導(dǎo)基因的隨機(jī)突變，導(dǎo)致細(xì)胞或動物表型的缺陷，直接進(jìn)行基因功能的篩選。但由于該方法 通常需要兩個(gè)等位基因同時(shí)突變才會出現(xiàn)明顯的表型，成功的機(jī)會比較低。而RNA干擾(RNA interference，RNAi)文庫有希望成為一種簡單、高 效、大規(guī)模、高通量的功能基因組學(xué)研究的工具。

1 RNAi及RNAi文庫

RNAi是近年來的重大發(fā)現(xiàn)，是動物和植物界普遍存在的一種防御反應(yīng)。RNAi被細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的雙鏈RNA(dsRNA)所激活，可以高度特異地抑 制同源基因的表達(dá)。根據(jù)目前的研究，RNAi的可能機(jī)制如下：長片段dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被Ⅲ型RNA酶Dicer切成長度大約為19～23 nt的小片段干擾 RNA(small interfering RNA，sirna)，由siRNA參與構(gòu)成復(fù)合物RISC(RNA-induced silence complex)。 siRNA通過與同源mRNA的特異配對，引 導(dǎo)RISC特異地降解同源mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。因此小片段的siRNA也可以誘導(dǎo)的基因沉默。

在線蟲，注射或喂食dsRNA能引起特異基因在動物各器官的沉默，而且該抑制作用可以持續(xù)到*代的子代動物。但是在哺乳動物細(xì)胞 ，通過長片段dsRNA直接轉(zhuǎn)染會引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，基因沉默效果差。近年來，陸續(xù)有用體外合成的 siRNA，或用質(zhì)粒、病毒等載體在細(xì)胞內(nèi) 表達(dá) siRNA達(dá)到在細(xì)胞和小鼠抑制特定基因表達(dá)的報(bào)道。

RNAi文庫(RNAi library)是人工構(gòu)建的能通過誘導(dǎo)RNAi抑制眾多不同基因表達(dá)的混合文庫，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或細(xì)胞庫，進(jìn)行表型的篩選。該技術(shù)在線蟲的應(yīng)用zui為成功。在線蟲等模式生物的研究中，應(yīng)用RNAi文庫建立隨機(jī)基因抑制的線蟲，再 進(jìn)行表型的篩選，已在其胚胎發(fā)育等領(lǐng)域取得了重要的發(fā)現(xiàn)。該文庫用含方向相對的兩個(gè)T7啟動子的載體，可從一個(gè)隨機(jī)克隆的cDNA模板分別 轉(zhuǎn)錄出長片段的正義和反義RNA，形成dsRNA，在體內(nèi)被Dicer切割成小片段的siRNA，特異地抑制靶基因的表達(dá)。由于細(xì)胞外dsRNA不能在哺乳動 物細(xì)胞有效地誘導(dǎo)RNAi，另外，長鏈dsRNA(>30nt)可導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞的毒性反應(yīng)，出現(xiàn)非特異的細(xì)胞生長停滯和凋亡，上述轉(zhuǎn)錄長片段dsRNA 建立RNAi文庫的方法不能應(yīng)用于哺乳動物及其細(xì)胞。

線蟲等模式生物與人的差距較大，從模式生物獲得的研究結(jié)果雖然有比較重要的意義，但不能取代在人和其他高等動物的直接研究。因 此建立可以用于人的細(xì)胞以及其他哺乳動物細(xì)胞的RNAi文庫有非常重要的意義。RNAi文庫將為研究基因功能、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶基因、發(fā)現(xiàn)疾病 相關(guān)基因、探索腫瘤治療新途徑等提供重要的方法。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道的在哺乳動物細(xì)胞建立RNAi文庫的方案有兩類。我們將對這兩類建 庫方案及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用作一介紹。