*步：準備好配制培養(yǎng)基的一切用具和試劑。

第二步：稱量5 g瓊脂和30 g蔗糖，溶解在大約所要配制培養(yǎng)基 2/3~3/4左右體積（約600~750 ml）的（蒸餾）水中，加熱溶解，不時攪拌，避免出現瓊脂生塊和泡沫。

第三步：根據用量，用量簡或移液管從母液中取出所需量的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素（每做1000 ml培養(yǎng)基，取20 ml大量成分、20 ml氯化鈣母液、10 ml微量成分、10 ml鐵鹽母液和10 ml有機成分，以及3.0 mg NAA），放入預先有少量蒸餾水的燒杯中（以免加藥液時濺出），然后加入瓊脂和糖水溶液中攪拌混勻。

第四步：加水定容。待攪拌均勻后，用數滴稀堿（NaOH）將pH值調節(jié)到預定水平（一般為pH 5.8），當pH值偏堿時用稀酸（HCl）調節(jié)。用pH試紙或酸堿指示（或pH）計測定培養(yǎng)基的pH值。

第五步：將培養(yǎng)基用漏斗分裝到培養(yǎng)容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加蓋。

第六步：培養(yǎng)基進行滅菌。高壓蒸氣滅菌鍋的溫度為121℃，滅菌15~20分鐘。

培養(yǎng)基常用高溫高壓（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸氣滅菌的方法，滅菌時間應根據培養(yǎng)瓶體積大小及其內培養(yǎng)基容量多少而定（見表4）。體積和容量越大，所需滅菌時間就越長。空試管、空三角瓶和濾紙要在130℃下滅30分鐘或121℃滅60分鐘。空的培養(yǎng)容器不應同盛裝培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器一起高壓蒸氣滅菌，不同體積培養(yǎng)容器或盛裝不同容量的培養(yǎng)基也不能一起高壓蒸氣滅菌，而應該分別進行。因為熱穿透力是一個需要考慮的因素，體積大的培養(yǎng)容器需要較長的時間滅菌，是因為熱量穿透大體積培養(yǎng)基要比體積小的花更多的時間。利用高壓蒸氣滅菌鍋進行滅菌具有簡單、快速，并且可以附帶殺滅病毒又不吸收的優(yōu)點（與過濾滅茵比較）。其缺點是會引起pH值的變化、發(fā)生化學變化和引起某些化合物的分解，使得某些培養(yǎng)基成分的活性喪失。高壓蒸氣滅菌會引起以下物質分解：蔗糖（分解為葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%會喪失反應活性）維生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性喪失）。所以，原生質體培養(yǎng)用培養(yǎng)基應采用過濾法滅菌。

表4 培養(yǎng)基或無菌水的zui少滅菌時間
容器分裝體積（mL） 121℃下zui少滅菌時間（min）
20~60 15
75~150 20
250~500 25
1000以上 30以上

過濾滅菌可以除去溶液或液體培養(yǎng)基中直徑大于過濾膜網孔直徑的微粒、微生物和病毒。與高壓蒸氣滅菌法相比，該法不會改變那些在高壓蒸氣滅菌中不穩(wěn)定物質，但是也有些明顯的缺點，如復雜而費時。通常采用0.22~0.45μm孔徑的醋酸纖維素或硝酸纖維素膜篩。對培養(yǎng)基中的不穩(wěn)定成分進行過濾滅菌時，首先對除不穩(wěn)定成分以外的培養(yǎng)基進行高溫高壓滅菌，滅菌后放置于超凈工作臺中冷卻，溫度降到40~50℃時，在瓊脂培養(yǎng)基尚未固化之前，在無菌條件下用注射器和無菌微孔濾膜（圖1.7）將高溫不穩(wěn)定物質溶液打入培養(yǎng)基。