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727次實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庹莆諜z測(cè)DNA 質(zhì)量的方法以及DNA定量的方法;了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)速率的因素;訓(xùn)練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性?xún)?nèi)切酶操作。
實(shí)驗(yàn)原理:參見(jiàn)系列一中實(shí)驗(yàn)二;限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn):見(jiàn)“基因操作原理”。
實(shí)驗(yàn)材料及試劑:水稻總DNA或BAC克隆DNA,瓊脂糖,限制性?xún)?nèi)切酶DraI,EcoRI,EcoRV,HindIII
實(shí)驗(yàn)步驟:
1.取10µl DNA于0.8% 凝膠檢測(cè);
2.將DNA調(diào)節(jié)濃度至300-400 ng/µl ;
2.仔細(xì)閱讀將所用的任何一種酶產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),熟悉反應(yīng)條件及酶切的貯存濃度(10U-50U/µl)廠家配套試劑;
3.計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量:(0.5 ml tube中)
DNA(3-5µg) 10µl
10´ buffer reaction 1.5µl
enzyme (15 U/µl) 0.8µl(冰上)
ddH2O 2.7µl
混勻,短暫離心;
4.37℃ 溫浴1-2 hrs (純DNA) 或10 hrs(粗制DNA);
5.加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng),也可65℃加熱10 min使酶變性失活;
6.電泳檢測(cè)酶切效率:
每個(gè)樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測(cè),制膠及點(diǎn)樣方法同上。
結(jié)果分析
若水稻DNA呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片,則酶切效果好,否則需重做;
DNA被切爛:DNA降解,重新提DNA;
DNA切不動(dòng):雜質(zhì)多(多糖,蛋白質(zhì),酚類(lèi),有機(jī)溶劑等),重新純化;
若是BAC克隆DNA,酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小DNA帶。
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