Commassie法（Bradford法）：

原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料G-250結(jié)合，顏色從棕色變?yōu)樗{色，在595nm處檢測吸光值然后與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。

BCA法：

原理：在堿性條件下，蛋白將Cu++還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

現(xiàn)對這兩種方法進行比較：

一、實驗材料：

細胞總蛋白提取試劑盒（AR0103）

M231

BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）

Commassie改良增強型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145）

二、操作步驟：

Commassie法：

1.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

2.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

3.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應(yīng)標記的微孔板中。

4.滴加200ul考馬斯增強型試劑（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S

5.停止震蕩，在室溫孵育樣品10min

6.在酶標儀中測量595nm時的吸光值。

7.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。

BCA法：

1.按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。

2.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

3.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

4.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應(yīng)標記的微孔板中。

5.滴加200ulBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S

6.停止震蕩，在37度孵育樣品30min

7.在酶標儀中測量562nm時的吸光值。

8.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。

三、實驗結(jié)果

 
其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的標準濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白

Commassie法： 

 

為了測試準確，應(yīng)在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。 由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.4mg/ml

Commassie法優(yōu)點是：

1.靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達1ug。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性。

3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：

1.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干擾Lowary法一樣）。

3. 標準曲線也有輕微的非線性，在0-1000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
BCA法： 
 

由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml

BCA法特點：    1. 靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，zui小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。    2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。    3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。    4. 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。  5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。