一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />了解用聚乙二醇PEG方法誘異同種植物原生質(zhì)體融合的技術(shù)，并能根據(jù)新本原生質(zhì)體的形態(tài)樗來(lái)鑒別雜種細(xì)胞。
二. 實(shí)驗(yàn)原理
不同種植物的原生質(zhì)體可在人工誘導(dǎo)條件下融合，所產(chǎn)生的雜種細(xì)胞，即異核體經(jīng)過(guò)培養(yǎng)可再生新壁，分裂形成愈傷組織，進(jìn)而分化產(chǎn)生雜種植株。由于進(jìn)行融合的原生質(zhì)體來(lái)自體細(xì)胞，故該項(xiàng)技術(shù)也叫體細(xì)胞雜交。原生質(zhì)體融合能使有性雜交不親合的植物種間進(jìn)行廣泛的遺傳重組，因而在農(nóng)業(yè)育種上具有巨大的潛力。在植物遺傳操作研究中也是關(guān)鍵技術(shù)之一。
人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合可使用物理學(xué)方法，如運(yùn)用細(xì)胞融合儀，在電場(chǎng)誘因?qū)聦?shí)現(xiàn)融合，然而至今廣為使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH鈣溶液相處理的化學(xué)方法（Kao等，1974）。該法應(yīng)用分子量至為1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH的鈣溶液稀釋時(shí)，就產(chǎn)生了高頻率的融合，融合的頻率和省略常與所有PEG的分子量、濃度，作用時(shí)間，原生質(zhì)體的生理狀態(tài)與密度以及操作者的細(xì)心程度有關(guān)。
三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
1． 實(shí)驗(yàn)材料：
煙草或其它植物無(wú)菌苗的葉片。
胡蘿卜肉質(zhì)根誘導(dǎo)的松軟愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
2．試劑
2.1 酶液及洗滌液，同植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
2.2 PEG溶液

Tris(緩沖液) 0.05mol/L
PH調(diào)至10.5
2.4 DPD培養(yǎng)基同植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
四、實(shí)驗(yàn)方法
所有操作均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
1． 原生質(zhì)體的分離和收集。參看植物原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
2． 將收集的兩種不同材料的原生質(zhì)體分別懸浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O（pH5.8~6.2）原生質(zhì)體密度調(diào)整為2×105/ml左右（用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體密度）。
3． 將兩種原生質(zhì)體懸液等量混合。
4． 用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴約
0.1ml。然后靜置10in，使原生質(zhì)體巾在皿底上，形成一薄層。（應(yīng)有3~5個(gè)平皿的重復(fù)）。
5． 用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置10~15min。此時(shí)可取一個(gè)平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。
6． 用刻度吸管向原生質(zhì)體液滴慢慢地加入高pH、商鈣稀液。*次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之間間隔5min。
7. 將平皿稍微傾斜，吸去上清液，再緩緩加入4ml稀釋液。5min后，再傾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液時(shí)勿使原生質(zhì)體漂浮起來(lái)。
8. 用DPD培養(yǎng)基如上法換洗二次。
9. 每平皿中加培養(yǎng)基2ml，輕輕搖動(dòng)平皿。
10.用蠟?zāi)っ芊馄矫蟆Ｖ?60下進(jìn)行24h暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1． 在倒置顯微鏡下觀察異源融合。在培養(yǎng)3天以內(nèi)，可根據(jù)雙新原生質(zhì)體的形態(tài)特征來(lái)鑒別異核體。因?yàn)閬?lái)自葉肉組織的原生質(zhì)體具有明顯綠色葉綠粒，而來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞的原生質(zhì)體無(wú)色，但具濃密原生質(zhì)絲，并可看到顯示的核區(qū)。
2． 統(tǒng)計(jì)異源融合的頻率