一、酶標抗體法

酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連結在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。

(一)酶的種類及特點

從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多?，F將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。

表4-1 免疫細胞化學常用的酶

名 稱    分 子 量    內 源 性    商 品
HorseerADIsh peroxidase(E.C.1,11,1,7)    40～45KD    +    有
Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1)    80～120Kd    ++    有
Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2)    100Kd    +++    有
Glucose oxidase    160～190kD    －    有
Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察;②所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位;③較易獲得的酶分子，有商品出售;④中性pH時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應改變，且酶的催化活性(Turnover)越高越好;⑤酶標過程中，酶與抗體連結，不能影響二者的活性;⑥被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。

其中，①②兩點甚為重要，因為并非容易顯示的酶均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP)較佳，是zui常用的一種酶。HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根(西洋山崳菜)的葉內含量zui豐富而得名。它是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合組成的一種糖蛋白，糖占16%～18(8條糖鏈分布在HRP分子表面)，分子量40kD，zui適pH5～5.5，zui適溫度40～45℃; pH4～11，50℃以下均較穩定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，zui大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值(Od 403/275)衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般認為，標記酶的RZ值為3.0左右，不應小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，例如RZ值為0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高達75%。對于純度低、質量差的酶，需純化后使用。

除HRP外，堿性磷酸酶(Alkaline phasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)也較常用。ALP分子量約為HRP的2～3倍，zui適pH9.0～9.5左右，比較穩定，內源性ALP也較易消除，大部分均可被 (Levamisole,分子量240.8kD)抑制，但腸粘膜表面的內源性ALP活性不受影響。目前所用的ALP大多系由牛的腸粘膜提取制得，所以腸粘膜等呈強陽性反應。

ALPzui初是由Bulman等用于標記抗體的。選用不同的底物，可形成不同顏色的終產物，例如以萘酚(As-Mx)和快藍(Fast Blue, FB)為底物，生成藍色沉淀。用快紅(Fast Red, FR)代替FB，形成紅色不溶沉淀。與HRP/4-氯-1-萘酚(CN)或DAB形成的沉淀形成鮮明對比，但FB、FR等沉淀物溶于有機溶劑，不能進行脫水、透明等處理。據報告，利用新品紅(New fuch-sine )顯色，形成的紅色沉淀產物不溶于有機溶劑，不褪色，輕度核復染后，可制成半*性保存標本。

GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍(P-Nitroblue Tetrazolium),終產物為不溶性的藍色沉淀，比較穩定。從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術。

(二)酶標抗體的制備(Boosma,DM, 1983)

酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯劑的作用，將酶連結在抗體分子上。偶聯劑是一種雙功能試劑，具備3個基本特征：①偶聯劑與抗體和酶之間的連結，必須是不可逆的，即借共價鍵連結;②偶聯劑不應影響酶和抗體的活性;③不能因偶聯劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結合。

在HRP標記抗體中，常用的偶聯劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等，現簡介如下。

1.戊二醛標記法 戊二醛為制備各種酶標抗體zui常用的偶聯劑。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯釋及戊二醛自身聚合本等雜質，故需純化后使用。戊二醛的純度用含雜質的二醛的單體戊二醛的OD比值表示，它們的zui大吸收光波長分別為235nm 和280nm，二者的OD比值(235/280)小于3時，制備酶標抗體的效果較好，大于3時，需經蒸餾或Sephadex G-10柱層析或活性碳吸附等處理，除去雜質后應用。其制備方法分一步法和兩步法;基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結合，將酶連結于抗體上。

(1)一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經透析除去標記物中剩余的戊二醛，制得酶標抗體。優點是簡單省時，缺點是反應程度不易被控制，因為酶蛋白分子和抗體蛋白分子同戊二醛間的反應速率不同，抗體蛋白的氨基數遠較HRP為多，與戊二醛反應快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內和分子間的彼此交聯，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯相應減少，影響酶的標記。據Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結，標記率較低(約1%～5%)很難獲得理想的酶標抗體。

(2)二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應(HRP：戊二醛為1：105)，以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結合，另一個醛基游離;然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP(HRP-戊二醛復合物)，再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結合，制成酶標抗體。過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結，避免酶本身聚合。根據所用的HRP與抗體(IgG)比例不同，酶標記率各異，平均為5%～25%。標記步驟如下：

①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中(0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，18h室溫。

②透析或 Sephadex G-25柱層析(0.15mol/l NaCl平衡)，去除過量的戊二醛，收集活化HRP。

③濃縮活化HRP至10mg/ml左右，加入抗體5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸鹽緩沖液(pH9.5)調整pH至9.0～9.5,使抗體與活化HRP結合，4℃24h。

⑤加入0.1ml賴氨酸緩沖液，阻斷未反應的醛基，4℃，2h。

⑥用半飽和硫酸銨沉淀5次，對PBS透析24h，4℃，換3次PBS，除去硫酸銨(10000rpm/min,30min)。

⑦或用凝膠色譜法(Sephadex G-200/Sephacryl S-200) 等分離標記抗體。

注意：該方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游離氨基較少，與戊二醛反應后，制成的酶標抗體大部分為單體;而RZ值小于2.8的HRP，含有較多的游離氨基，與戊二醛反應后，易形成多聚體，使方法的敏感性下降。

2.過碘酸鹽氧化法 嚴格地講，過碘酸鈉(Sudium periodate)不是一種真正的偶聯劑，其本身并非作為橋連結在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶(如HRP)的標記。我們知道，HRP分子的糖本身與酶活性無關，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應，生成Shiff’s堿。此Shiff’堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經氫硼化鈉(NaBH4)還原，形成穩定的酶標抗體復合物(圖4-1)。為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯，預先可用二硝基氟苯(Dintro-fluorobenzene)處理HRP，阻斷分子內的ε-、α-氨基。

免疫酶細胞化學—染色方法

HRP特異底物為H2O2,在分解H2O2過程中,與H2O2形成復合物,無電子供體存在時,反應不再進行,當電子供體存在時,迅速生成水,酶被還原,電子供體被氧化環化,形成苯乙胼聚合體(圖4-2)。在酶反應部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。

免疫酶細胞化學—染色方法

圖4-3 兩步酶催化反應原理

二、非標記抗體酶法

由于酶標抗體存在一些缺點，例如①酶與抗體間的共價連結可損害部分抗體和酶的活性;②抗血清中的非特異性抗體被酶標記后，與組織成分結合，可致背景染色等。為此Sternberger等在酶標法的基礎上，發展了非標記抗體酶法。包括酶橋法(Enzyme Bridge Method)和過氧化物酶抗過氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)?，F分述如下。

(一)酶橋法

1.基本原理 首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后使用第二抗體作橋，將抗酶抗體連結在與組織抗原結合的*抗體上，再將酶結合在抗酶抗體，經呈色顯示抗原的分布。在此過程中，任何抗體均未被酶標記，酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結合，避免了共價連結對抗體和酶活性的損害，提高方法的敏感性，且能節 省*抗體的用量。

2.染色步驟 主要程序如圖4-4

免疫酶細胞化學—染色方法

一般HRP/抗HRP的克分子比達1.9時，可分裝冷藏于-85℃冰箱，據報告如此冷藏的PAP復合物可保留14年之久，活性無改變。但稀釋后的PAP復合物不穩定，4℃可保存2～3周。臨用前配制。

【PAP復合物的特征】

PAP復合物的形成不同于其它抗原抗體反應，在抗原稍過量時，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數抗原抗體反應需要抗原過量才能形成可溶性復合物。PAP復合物的形狀相當穩定，不受抗原量的影響，無論zui初加入的抗原抗體過量與否，zui終形成的PAP復合物其HRP/抗HRP之比絕大部分為3：2。應用離心沉降、液相擴散等方法分析表明：PAP復合物沉降系數為11.5s,分子量為400～430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成，呈五角形結構，3個角為HRP，另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2-DAB染色，電鏡下已經觀察到PAP復合物五角形環狀結構，直徑平均21nm 。這種結構異常穩定。據報告PAP復合物的抗HRP抗體與HRP結合常數為108，在此可溶性復合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩定性。

2.PAP染色原理及步驟

(1)原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結在與組織抗原結合的*抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3、4合并為1，用PAP復合物代替，即第三步用PAP復合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復合物中的抗HRP抗體和*抗體為相同種屬動物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復合物連結在*抗體上。

(2)染色步驟：主要步驟與酶橋法相似，如圖4-5。

①切片準備及*抗體孵育前處理同間接法;切片與特異性*抗體孵育同酶橋法。

②用過量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。

免疫酶細胞化學—染色方法

圖4-6 間接酶標抗體法

免疫酶細胞化學—染色方法

圖4-8 示假陰性：組織切片上結合過多的*抗體，兩抗體間的距離d 恰好適于橋抗體的兩個Fab段與之結合，無PAP復合物結合的位置

(5)橋抗體：也稱連結抗體，它的兩個Fab段具有相同的結構、性質及與抗原結合的能力。因此，當*抗體和PAP復合物中抗HRP抗體來自同一種屬動物時，橋抗體能同時與上述兩種抗體結合，起到橋的作用。為了確保橋抗體的兩個Fab段之一與*抗體結合、另一個與抗HRP抗體結合，橋抗體需用高濃度。另外，在非標記抗體酶法中可用葡萄球菌蛋白A(SPA)代替橋抗體，進行ICC染色。SPA不受種屬限制，應用范圍廣。

(6)PAP復合物：在PAP法及酶橋法中，特別強調*抗體和抗HRP抗體必須來自同一種屬，橋抗體才能發揮橋的作用，將其連結在一起;但一些研究表明：*抗體和抗HRP抗體來自不同種屬，連結抗體仍可作為橋，將二者連在一起。例如Erlandsen發現豚鼠IgG作為*抗體，可用羊抗兔IgG、兔PAP復合物顯示之一。Grzanna(1982)根據這一報告，利用豚鼠抗DBH血清作*抗體，羊抗兔IgG為橋抗體，12例兔血清制得的PAP復合物中，僅3例染色較佳。這種*抗體和PAP復合物來自不同種屬獲得的陽性結果主要依賴于種屬間的交叉反應。多數實驗表明：抗體和種屬交叉反應是有限的，也是不*的。故利用橋抗體進行ICC染色時，仍以*抗體和抗酶抗體來自同一種屬為宜。