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單克隆抗體技術:細胞融合

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(一)融合劑 
細胞融合的方法有物理法,如電融合、激光融合,化學融合法和生物融合法,如仙臺病毒,此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。 
聚乙二醇(PEG),在分子量為200~700時,呈無色、無臭的粘稠狀液體,分子量大于1 000時,呈乳白色蠟狀固體,能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑,對熱穩定,與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4 000者,常用濃度為50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3調整),分子量小的PEG,融合效應差,又有毒性,分子量過大,則粘性太大,不易操作。50%濃度,pH偏堿時融合效應zui高。 
也有采用30%~50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。 
不同批號的PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的,一般選供氣相色譜用的PEG。 
(二)融合過程 
融合的方法很多,常用的有轉動法和離心法。 
融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1zui為常用。 
1.試劑與材料 
(1) 供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。 
(2) 1640培養液100ml。 
(3) *1640液100ml。 
(4) 2.5%FCS-1640液50ml。 
(5) HAT培養液100ml。 
(6) 50%PEG:取分子量4 000,高純度的(日本進口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調整。 
(7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。 
(8) 40孔塑料培養盤。 
2.操作方法 
⑴ 準備好脾細胞。 
⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞,并加入50ml 2.5%FCS-1640液。 
⑶ 室溫400g離心3min,使細胞沉淀。 
⑷ 移去上清液。 
⑸ 輕敲管底部,使沉淀流動,把沉淀管放于40℃水浴中,使其達融合溫度。 
⑹ 加預熱至40℃的50%PEG 0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見有顆粒出現,滴加過程要求持續2min。 
⑺ 加1ml1640液,邊加邊搖動,持續1min。 
⑻重復⑺一次。 
⑼ 加1ml 1640液,邊加邊搖動,持續0.5min。 
⑽ 重復⑼一次。 
⑾ 加1640液15ml。 
⑿ 室溫,400g離心1min,使細胞沉淀。 
⒀去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的*1640液。 
⒁ 往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液,每孔1滴(約0.05ml)。 
⒂ 輕搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。 
⒃ 第3、6、9、10日換入含HAT的*1640培養液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細胞吸出,根據需要加入適量的飼養細胞。 
⒄ 于第12、15日加入含有HAT的*1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現,但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后,吸取上清液,檢查抗體。 
⒅ 對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中,依情況取消HAT液和*1640液而代之以10%FCS-1640液。同時保存于液氮和進行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產生抗體細胞的變異和丟失。 
(三)細胞融合的關鍵 
1.技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。 
2.融合試驗zui大的失敗原因是污染,融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境,以及適宜的無菌操作技術。

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