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上海士鋒生物科技有限公司
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免疫熒光技術(shù)之熒光顯微鏡檢查方法

時間:2015/1/5閱讀:681
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、熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具,分透謝和落射二種類型,落射光無需鏡內(nèi)操作,方便、效果更好。它是由超高壓光源、濾板系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。

2、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求
(1)載玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2 mm之間,太厚的玻片,一方面光吸收多,另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。載玻片必須光亮清潔,厚度均勻,無明顯自發(fā)熒光,有時需用石英玻璃載玻片。
(2)蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17 mm左右,光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光,也可用干涉蓋玻片,這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片,它可以使熒光順利通過,而反射激發(fā)光,這種反射的激發(fā)光又可激發(fā)標(biāo)本。
(3)標(biāo)本
組織切片或其它標(biāo)本不能太厚,若太厚,激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋,背景非特異染色引起的熒光影響結(jié)果判斷。
(4)封裱劑
封裱劑常用甘油,必須無自發(fā)熒光,無色透明,熒光的亮度在pH8.5~9.5時較亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5 mol/L pH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。如果用抗褪色劑封裱熒光染色標(biāo)本更有利于顯微攝影。配方是將P-次苯基二胺二氫氯100 mg加入PBS10 m中,調(diào)pH至9.0~9.5,再加入甘油90 ml,混勻,在室溫放置過夜,待其中小氣泡*消失即可使用。
(5)鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時,必須使用鏡油,使用特制的無熒光鏡油,可用甘油代替,液體石蠟也可用,只是折光率較低,對圖像質(zhì)量略有影響。對于落射光熒光顯微鏡BX60,Nikon E-1000無須鏡油。

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