隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達異源蛋白質(zhì)的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件。因此研究啟動子的克隆方法，對研究基因表達調(diào)控和構(gòu)建表達載體至關(guān)重要。

　　迄今為止，國外尚未見到有關(guān)啟動子克隆方法的綜述性報道，國內(nèi)僅孫曉紅等曾就啟動子的結(jié)構(gòu)、分類、克隆方法和食用菌中已經(jīng)分離到的啟動子作過綜述。而近年來又有許多改進的克隆啟動子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來改進的啟動子克隆方法作一綜述，以期促進對啟動子分離技術(shù)的應(yīng)用。

　　1　啟動子克隆的幾種方法

　　1.1　利用啟動子探針載體篩選啟動子

　　啟動子探針型載體是一種有效、經(jīng)濟、快速分離基因啟動子的工具型載體，包含2個基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復制起點和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細胞；檢測單元則包括1個已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測的遺傳標記基因以及克隆位點。

　　利用啟動子探針載體篩選啟動子的過程為，先選用1種適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA，然后將切割產(chǎn)生的DNA限制片段群體與無啟動子的探針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè)計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細胞，構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。

　　當插入段同時滿足(1)具有基因啟動子序列；(2)具有翻譯啟始區(qū)；(3)具有啟始密碼子；(4)插入方向正確；(5)插入片段3"端編碼區(qū)序列抗性基因編碼區(qū)讀碼框一致，則有可能形成有功能的抗性融合基因，從而啟動抗性基因的表達。

　　zui早由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報告基因構(gòu)建了啟動子探針質(zhì)粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核啟動子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報告基因，F(xiàn)odor等以大腸桿菌LacZ為報告基因，構(gòu)建了酵母啟動子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動子片段。構(gòu)建啟動子探針型載體，較為常見的檢測標記基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、四環(huán)素抗性基因(Tet")和卡那霉素抗性基因(Kan")。近年來，人們漸漸較多地使用潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因作為檢測標記基因。李維等曾構(gòu)建了含有hph抗性基因的啟動子探針型載體pSUPV8，直接在大腸桿菌中分離黃孢原毛平革菌基因的啟動子。先用Sau3AI酶切黃孢原毛平革菌基因總DNA，再與用BamHI酶切后的pSUPV8相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用間接篩選法從氨芐青霉素和潮霉素抗性平板上篩選重組子，得到6個雙抗重組子(pCH1～pCH6)，電泳檢測插入片段分別命名為CHl～CH6；再用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組子分別轉(zhuǎn)化黃孢原毛平革菌，對獲得的轉(zhuǎn)化子進行復篩，僅pCH6的轉(zhuǎn)化平板上有穩(wěn)定生長的菌落，說明了CH6片段在黃孢原毛平革菌中具有啟動基因表達的功能。該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機篩選啟動子，避免了引物設(shè)計，能獲得大量的啟動子片段。

　　1.2　利用PCR技術(shù)克隆啟動子

　　即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計引物，克隆基因的啟動子，由于PCR法簡便快捷，近年來人們較多采用此方法克隆基因啟動子。

　　蘇寧等根據(jù)已報道的水稻葉綠體16SrRNA啟動子基因序列設(shè)計5"啟動子序列的引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴增出16SrRNA基因5"啟動子區(qū)的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位點，構(gòu)建測序載體質(zhì)粒pZ16S，進行序列測定，結(jié)果表明所克隆的片段長為144bp，含有SD序列。同源比較結(jié)果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動子序列具有100％的同源性。

　　上述的PCR方法簡便、快捷、操作簡單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。