細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前zui常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒dna的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法是一種應(yīng)用的制備質(zhì)粒dna的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中;蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實驗室中常用。

一、試劑準(zhǔn)備

1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4℃。

2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/em>

4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/em>

5.苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)

6.乙醇(無水乙醇、70%乙醇)

7. 5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/em>

8.溴化乙錠(EB)：10mg/ml

9.RNase A(RNA酶A)：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10. 6×loading buffer(上樣緩沖液)：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。

11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至*溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml(注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時帶手套)，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中(電泳緩沖液0.5×TBE)，即可上樣。

二、操作步驟

1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB(含相應(yīng)抗生素)液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr)。

2.取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3.將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4.加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻(不要劇烈振蕩)，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解(溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清)。

5.加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000g × 10min。

7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4℃離心12000g×15min。

8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。

9.沉淀溶于20μl TE(含RNase A 20μg/ml)，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>

三、質(zhì)粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的zui簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

四、注意事項

本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復(fù)性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。