PCR的假陽性問題深受重視，但我個人認為PCR假陰性問題相對于臨床檢測更為嚴重。其實PCR假陽性的問題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴格的實驗室管理，合理的環(huán)境設(shè)置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問題基本屬于廠家試劑質(zhì)量問題。而PCR的假陰性卻不同，它涉及了與PCR實驗的幾乎所有人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，大三陽檢出率低、甚至于GC鏡下都很多時，PCR仍為陰性的事情也經(jīng)常發(fā)生，可見假陰性問題的嚴重性。

　　就PCR假陰性問題總體來說有如下因素：

　　一． 儀器因素

　　PCR實驗對儀器的依賴性是很高的，離心機、擴增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴增儀的主要問題是孔間差，引起擴增失敗可擴增效率降低。而離心機的影響則更容易被忽視。國內(nèi)使用離心機很少使用離心加速度（XXXg）作為參數(shù)指標，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù)指標，這里就存在著一個問題，由于離心機的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大(有的在數(shù)倍以上)，所以在相同的離心時間下，有可能模板并沒有離心下來，造成PCR假陰性。這個問題在其他實驗也有，但因基他實驗都是測定大分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機的實驗要注意一下這個問題。

　　二． 試劑質(zhì)量問題

　　PCR實驗的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細胞的裂解；模板的抽提；引物位點的選擇；taq酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。

　　三． 核酸模板問題

　　核酸模板質(zhì)量問題是制約PCRzui重要的因素之一。核酸模板在擴增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附、空間位阻等模板質(zhì)量問題都有可能引起擴增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準確。由于無論什么提取方法都不可能得到*理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)，但它不可能由試劑質(zhì)量完*。

　　核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、離子等）作用，而導(dǎo)致擴增效率降低甚至擴增失敗的問題。對此，有人提倡進行模板純化，效果較為明顯。但另一個問題又出現(xiàn)了，那就是怎樣保證純化的回收率問題。總之，核酸模板問題是不可避免的問題，只能努力去減少。

　　四． 操作人員素質(zhì)問題

　　PCR實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計錯誤、對于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實驗操作人員有很好的素質(zhì)，能夠嚴格遵守操作規(guī)程，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。

　　五． 其他

　　PCR實驗中從樣品的采集、運輸、保存開始就可以引起結(jié)果的假陰性，而對于病原體檢測（如HBV）在人體血液系統(tǒng)出現(xiàn)有周期性變化也是值得注意的因素。