堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學研究的實驗室每天都要用的常規(guī)技術(shù)。可以我收研究生十幾年了，幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什么都知道的學生卻對堿法質(zhì)粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因為《分子克隆》里面只講實驗操作步驟，而沒有對原理進行詳細的論述。這是導(dǎo)致我的學生誤入歧途的主要原因。后來我發(fā)現(xiàn)其實是整個中國的相關(guān)領(lǐng)域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老師”也是這個狀態(tài)。這就不得不讓人感到悲哀了。我想這恐怕和我們的文化有點關(guān)系。中國人崇尚讀書，“學而優(yōu)則仕”的觀念深入人心。經(jīng)常聽到的是父母對他們的獨苗說，你只要專心讀好書就可以了。所以這讀書的定義就是將教課書上的東西記住，考試的時候能拿高分……這就是現(xiàn)代科學沒有在中國萌發(fā)的根本原因。如果中國文化在這一點上不發(fā)生變化，那么科學是不能在中國真正扎根的，它只能蛻化成新的“八股學”。生命科學是實驗科學，它講究動手。如果實驗科學只要看看書就可以了，那我想問有那位*看看書就會騎自行車了？或者聽聽體育老師的講解就會滑冰了？可是光動手不思考，不就成了一個工匠？一個合格的生命科學研究者，需要在這兩方面完善自己。一個杰出的科學工作者，是一個熟知科學原理并善于應(yīng)用的“藝術(shù)家”。每個曾經(jīng)用堿法抽提過質(zhì)粒的同學，希望你看本文后能有所思考，讓中國的未來有希望。

為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后zui大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，
幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為zui終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或lb培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊.輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。

事實上NaOH是的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：

*，時間不能過長，千萬不要這時候去接，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；

第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細說明。

每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。zui容易產(chǎn)生的誤解是，當SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。