一、重組蛋白質的誘導表達

1. 挑取轉化有質粒的單菌落， 接種于3ml 選擇性 LB 液體培養基中，37℃，250rpm/min振搖培養過夜。

2. 次日將培養過夜的菌液 500 μl 再接種于 10 ml（1: 20）選擇性LB 液體培養基中，37 ℃，250 rpm/min振搖培養至光密度（OD600=0.6）時，取 1 ml 樣本作 為誘導前標本，10000g 離心 1 min 收集菌體沉淀，－20 ℃  凍存備用。

3. 加入 1 mol/L IPTG于菌液中，使 IPTG 終濃度為 1 mM，37℃ ，250 rpm/min振搖培養 4～5 小時。取 1 ml 樣本作為誘導后標本，同上法收集菌體沉淀， －20 ℃  凍存備用。

4. 將誘導前后菌體沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0） 重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離， 考馬斯亮藍染色 3 小時后，脫色觀察結果。

5. 選取誘導成功的細菌克隆，擴大誘導規模，收集菌體沉淀，于－20 ℃  保存， 準備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質的分離純化 重組蛋白質的可溶性鑒定

1. 將按上法誘導培養后收集的菌體重懸于裂解液   1 (Lysisbuffer under native conditions) 中，然后在－80℃低溫冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解凍。

3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌 6 次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V 。

4. 10000g，4℃  ，離心20 min，取上清（為溶液A ） ，－20 ℃  保存；另將沉淀用同樣裂解液 1 溶解（為溶液 B ） ，同樣－20℃ 保存，供后繼分析使用。

5. 將上述 A 、B 溶液和誘導前后的細菌進行 SDS-PAGE電泳， 考馬斯亮藍染色， 比較分析重組蛋白質的溶解性。如果誘導表達的蛋白質位于A 溶液中，則為 可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化

1. 將菌體沉淀溶于適量裂解液 2 （Lysisbuffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 10000g，4℃，離心 30 min，收集上清液。

3. 將 Ni-NTAAgarose充填柱子，并連接于 Pharmarcia低壓液相層析系統，用 5倍柱體積的裂解液 2 平衡 Ni-NTAAgarose，調節 A 280 值至零線。

4. 將適量上清液上樣到 Ni-NTAAgarose 柱子中，并用 lysisbuffer 沖洗至 A 280值低于 0.01。

5. 分別用 5～10 倍柱體積的清洗液 1 和清洗液 2（Washbuffer 1 and2）清洗柱子，直至 A 280 值低于 0.01。

6. 用洗脫液（Elutionbuffer）洗脫重組蛋白質，在 A 280 值監測下，收集出現峰 線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質的復性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，zui終用0.01×PBS 透析，透 析后的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白 (BSA)為標準，采用 BIO-RAD 公司蛋白質定量試劑(proteinassay)比色測定蛋白質的含量。